[发明专利]半定量检测氧化低密度脂蛋白的胶体硒试纸条

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种能快速、半定量检测出血浆样品中氧化低密度脂蛋白及其含量的胶体硒试纸条，可应用于动脉粥样硬化性心血管病的早期辅助临床诊断。

二、背景技术

许多研究表明氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)具有致动脉粥样硬化(AS)作用。而动脉粥样硬化又是冠心病、高血脂、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病发生的前期病理基础。OX-LDL在AS中的作用首先是促进泡沫细胞形成，在AS形成早期起到类似炎症介质的作用。其次是OX-LDL对血管内皮细胞(VEC)、血管平滑肌细胞(VSMC)具有高度的细胞毒性，改变VEC形态和结构而破坏内皮的完整性，使血中单核细胞和LDL等成分进入内皮下层，促进AS发生。血中OX-LDL增加可加速冠脉粥样硬化斑块与巨噬细胞结合、泡沫细胞形成和斑块内酯核增大，造成粥样斑块不稳定。许多研究显示，在高血压、高血脂及高血糖病人血浆中，OX-LDL有明显增高，且随病情的进展而逐渐增高。这些研究足以说明血浆OX-LDL增高与动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)的发生率和死亡率有密切关系。

临床研究发现健康人体内OX-LDL含量在0.2～0.5μg/ml之间，当临床上检测OX-LDL含量大于0.6μg/ml时认为异常。由于OX-LDL是AS病灶中特有的成份，其含量远高于正常人；在AS不同时期OX-LDL含量有显著性差异，病变越到晚期，OX-LDL的含量越高，所以它对ASCVD辅助诊断的特异性要优于常规血脂项目，故OX-LDL的检测对ASCVD的早期辅助诊断具有极其重要的意义。

目前检测OX-LDL的方法很多，核磁共振、apoB荧光检测、酶联免疫吸附法(ELISA)检测等，其中最常用的是ELISA法检测血清OX-LDL的含量。ELISA法是以竞争性酶联反应为检测原理，以OX-LDL抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶标结合物同时加入酶标板，反应后通过显色测OD值来判定结果。但该方法存在的缺点是：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长；(4)检测所需费用较高，不能实现单份检测。因此，目前有不少研究者将目光集中于检测人血清中氧化低密度脂蛋白的胶体金试纸条，例如发明专利200510200394.6，但是金颗粒的制备方法比较繁琐，需要加热，耗时较长，且标记的蛋白量较多。所以，本发明做了重大改进，将标记抗体蛋白的胶体金颗粒换成了胶体硒颗粒。

胶体硒免疫层析技术作为一种快速临床诊断技术，其特点是单份检测，方便快捷，除商品试剂外无需任何仪器设备，几分钟即可肉眼观察结果，且保质期长。本发明的半定量检测氧化低密度脂蛋白的胶体硒试纸条既具有ELISA酶法的高灵敏度，又具有半定量功能，能够取代传统机器检测定量的地位，大幅降低检测成本。对于体外快速检测血浆中氧化低密度脂蛋白的含量是很有意义的。行对于胶体金试纸，胶体硒试纸有以下优势：胶体硒颗粒的制备可以在常温下进行，不需要加热，反应时间短，产量高，且胶体硒颗粒灵敏度高，标记蛋白质用量比常规方法用量低，达到了方便、省时、灵敏度高的的特点。另外，胶体硒标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试纸比较稳定，可在室温下保存一年以上。

三、发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简便、检测快速、准确的专门用于快速半定量检测人血浆中氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)含量的免疫胶体硒试纸条及其制备方法。

本发明的技术路线叙述如下：

1)胶体硒的准备；

2)胶体硒标记物的制备：胶体硒与OX-LDL单克隆抗体1按一定比例混匀，使胶体硒与抗体形成单克隆抗体1-胶体硒标记物。选择OX-LDL单克隆抗体1作为硒标记抗体，将小分子单抗用双蒸水透析过夜，调整其浓度为1mg/ml，用0.22μm微孔滤膜过滤，取硒胶溶液100ml，调其pH为8.2，用0.22μm微孔滤膜过滤。在电磁搅拌下，向硒胶溶液中逐滴加入2.5ml稀释的需检小分子单抗，10min后，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，继续搅拌10min。将标记好的胶体硒用蔗糖透析，浓缩至原体积的1/10，再以1500rpm离心30min，上清加入到丙烯葡聚糖S-400凝胶拄中，用0.02mol/l pH8.2 TBS(内含i％BSA，0.05％叠氮钠)洗脱，收集颜色峰值时的液体，4℃保存备用；

3)将加样膜、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC背衬裁剪成规定大小；