[发明专利]快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诊断试条，具体是快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法。

背景技术

阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis，T.v)是一种寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛虫，可引起滴虫性阴道炎、前列腺炎和尿道炎等多种生殖系统疾病。滴虫病是常见的性传播疾病(STD)，该病呈全球分布，人群普遍易感。此病也与男性不育有关。除引起泌尿生殖道感染外，T.v也是HIV感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。目前国内外临床常规检查方法有生理盐水涂片法、培养检测法及免疫学方法(如ELISA、直接荧光抗体试验(DFA)、乳胶凝集试验(LAT)等)等。生理盐水涂片法(湿片法)简便易行，但该法只能检测活虫，虫体易与白细胞相混淆，检测结果与操作人员技术熟练程度有关，检出率仅为35％～80％。而培养检测法有利于提高检出率，但检测周期较长，一般需要2～7d(天)。免疫学方法虽然敏感性高，但操作较繁琐。PCR技术检测阴道毛滴虫虽具有较高的敏感性和特异性，但容易出现假阳性或假阴性反应。因此有必要研制一种特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的滴虫病诊断方法。而近年来发展起来的胶体金免疫层析检测技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的特点。胶体金免疫层析检测技术通常采用试条检测方式。试条一般包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、NC膜及吸水层，将试纸条浸入待检标本，标本中抗原与结合垫中的金标单抗结合后形成抗原抗体复合物，通过层析运动到NC膜上，与包被单抗发生反应，形成双抗体夹心复合物，出现红色可见条带，达到检测目的。目前尚无用于快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条。

发明内容

本发明的目的在于为克服现有技术的不足而提供一种特异性强、灵敏度高、简便快速、不易出现假阳性或假阴性反应的快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法。

本发明为达到上述目的所采用的技术解决方案如下：一种快速检测阴道毛滴虫的免疫层析试条及制备方法，包括衬板和设置在衬板上依次搭接的样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有包被点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层，其特征在于：所述的金标单抗为胶体金标记的单克隆抗体AP33中的一株，所述点膜单抗为单克隆抗体AP33中的另一株。

制备试条的方法包括以下步骤：

1)单抗的纯化杂交瘤细胞培养上清和腹水，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，除去较大的凝块及脂肪滴，然后分别依次用50％、33％饱和硫酸铵沉析1次，再通过蛋白A亲和层析柱收集、合并洗脱液中含蛋白的部分，然后将其置于0.01mol/L PB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl中透析，换液35次，4℃条件下900012000r/min离心1h，除去聚合物，得到纯化好的单抗，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；

2)胶体金的制备取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％柠檬酸三钠1-2ml，加热煮沸使溶液由蓝逐渐变为紫红色，直至变红，即为胶体金溶液，并用紫外分光法确定胶体金最大吸收峰；

3)胶体金探针的制备确定胶体金标记蛋白的最适稳定量，将胶体金的PH值调至8.2，加入最适稳定量的单抗，搅拌混合1530min，加1％的BSA或0.05％的PEG20000，继续搅拌15-60min，在4℃环境中静置1-2h；4℃条件下1500-3000r/min离心10-20min，取上清液，接着在4℃条件下，9000-12000r/min离心20-60min，小心吸弃上清液，沉淀用金标保存液0.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl重新悬浮至原体积的1/10，用0.45μm滤膜过滤，4℃环境中避光保存备用，所述金标保存液中含1％的BSA或0.05％PEG20000、0.05％NaN₃；

4)试纸条的组装①将衬板、样品垫层、结合垫层、包被NC膜及吸水层裁剪成适当尺寸，浸泡在处理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37℃烘干16h以上备用，所述处理液中含1％BSA、0.02％PEG20000、0.1mol/LNaCl、1％NaN₃；②将金标单抗、点膜单抗、羊抗鼠二抗制成工作浓度，将金标单抗喷涂在结合垫层上，将点膜单抗和羊抗鼠二抗喷涂在NC膜上制成检测线和质控线，将样品垫层、喷有金标单抗的结合垫层、喷有点膜单抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水层依次搭接在衬板上组成试条，置37℃烘箱烘2030min，将试条与干燥剂一起装入铝箔袋内，4℃密封贮存。