[发明专利]三维细胞培养插入件、其制造方法、成套用具及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于活细胞贴附、增殖和分化的多孔三维细胞培养插入件。本发明还涉及形成和制造所述插入件的方法，以及使用该插入件在细胞培养平板(例如塑料培养皿和多孔组织/细胞培养平板)、细胞培养瓶和生物反应器中培养哺乳动物细胞的方法。本发明属于细胞、组织培养领域。

背景技术

现有技术中，常规使用的主要的细胞培养方式包括以下两种：

1)以单层二维方式培养细胞

细胞培养是一种在药物开发、细胞生物学、毒理学、生物工程以及组织工程领域中非常有用并且被广泛使用的技术。常规的细胞培养是在细胞培养平板如2、4、6、24、96孔细胞培养板中进行，上述细胞培养板由非降解性的聚合物例如聚苯乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯制成。这些平板往往用等离子体(plasma)处理其表面，这是组织培养平板的生产者通常采用的技术，用于改进其表面的亲水性，从而使得培养的细胞可以更好地粘附于所述培养平板的二维表面。在一种典型的细胞培养实验中，在该聚苯乙烯细胞培养平板中培养的细胞在细胞培养基中以一种二维方式单层生长。

2)以三维方式培养细胞

二维(2D)细胞培养是一种用于制备、观察和研究细胞以及它们与药物、生物因子和生物材料在体外相互作用的方便的方法。但这与所述细胞在体内的生长方式并不相仿。在真实的活体内，细胞往往是三维(3D)生长的并且其构建形成三维的活组织或器官。越来越多的证据表明体外的三维细胞培养体系可以促进对在正常和病理的组织条件下的结构-功能关系的了解。为了研究这种功能性和形态学上的相互作用，一些研究者已经探索使用三维的凝胶基质，例如胶原凝胶[Douglas WHJ，Moorman GW，和Teel RW，The formationof histotypic structures from monodisperse fetal rat lung cellscultured on a threedimensional substrate.In Vitro 1976；12：373-381]、明胶、血纤维蛋白、琼脂糖和藻酸盐[Gruber HE，Fisher EC Jr，Desai B，Stasky AA，Hoelscher G，Hanley EN，Human intervertebral disc cellsfrom the annulus：Three dimensional culture in agarose or alginateand responsiveness to TGF-β1.Exp.Cell Res.1997，235：13-21；GruberHE，Stasky AA，Hanley EN Jr，Characterization and phenotypic stabilityof human disc cells in vitro.Matrix Biol.1997；16：285-288]。在这些凝胶体系中，将细胞培养在凝胶基质内，它们在其中以三维的方式生长。近来的研究已经显示，与单层生长的细胞相比，培养在三维的藻酸盐或琼脂糖凝胶体系中的人椎间盘细胞(human annulus disc cells)显示出不同的形态，增加了含蛋白多糖的合成，并且形成带有沉积在细胞周围和之间的胞外基质的多细胞集落[Gruber HE，Fisher EC Jr，Desai B，Stasky AA，Hoelscher G，Hanley EN，Human intervertebral disc cells from theannulus：Three dimensional culture in agarose or alginate andresponsiveness to TGF-β1.Exp.Cell Res.1997，235：13-21；Gruber HE，Stasky AA，Hanley EN Jr，Characterization and phenotypic stabilityof human disc cells in vitro.Matrix Biol.1997；16：285-288]。此外，在所述三维藻酸盐凝胶体系中培养的人椎间盘细胞证实产生了I型和II型胶原，而该I型和II型胶原在单层细胞培养时未有发现[Gruber HE和HanleyEN，Jr，Human disc cells in monolayer vs 3D culture：cell shape，division and matrix formation，BMC Musculoskeletal Disorders，2000；1：1]。体外动物细胞的三维生长促进正常上皮细胞的极化和分化[RoskelleyCD，Bissell MJ，Dynamic reciprocity revisited：a continuous，bidirectional flow of information between cells and the extracellularmatrix regulates mammary epithelial cell function，Biochem Cell Biol1995；73(7-8)：391-7]。与活组织细胞相比较，三维培养的细胞地移动和分裂得更快并且具有一种特征性的不对称外形[Cukierman E，PankovR，Stevens DR，Yamada KM，Taking cell matrix adhesions to the thirddimension，Science，2001；294(5547)：1708-12]。