[发明专利]高细胞毒性靶向融合蛋白

说明书

一.技术领域

本发明属于生物基因工程中的导向融合蛋白领域，目前癌症仍然是死亡率位居第二的疾病，目前人们还没有特别有效的手段来进行治疗，化疗仍然是目前最常用的治疗方法，虽然有一定的疗效，但是其副作用大，治疗效果只有部分理想，治疗时容易产生耐药株细胞等缺点影响了这种方法的疗效和有效率。

导向治疗是一种有望代替化疗的新的治疗手段，有多篇文献和专利(中国专利：应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580.3；中国专利：一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白，03137587.1；中国专利：高效低毒的系列功能蛋白，200410033621.6)报道了关于使用人促黄体激素释放因子(GnRH)及其衍生物与假单胞杆菌外毒素A(PE)构建靶向融合蛋白，可以用于肿瘤的靶向治疗；另有文献(Mol Microbiol.1999 Mar；31(5)：1385-93.Adeletion within the translocation domin of Pseudomonas exotoxin A enhancestranslocation efficiency and cytotoxicity concomitantly)报道了将PE毒素的359-365位氨基酸缺失后，PE毒素的活性会大幅度提高；还有文献(US Patent 5602095，Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity)报道将PE末端5个氨基酸REDLK突变为KDEL后，PE的活性也会大幅度提高。基于此并结合蛋白质三维分析，本发明为了得到活性更高的靶向融合蛋白，针对靶向融合蛋白GnRH-PE40(SEQ ID NO：1)进行了如下改构：

1将PE40的359-365位氨基酸进行了缺失(即为PE39)。

2将PE39的末端5个氨基酸REDLK突变为KDEL(即为PE39KDEL)。

最终我们得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL，在肿瘤治疗方面有很高的应用价值。

二.背景技术

目前癌症的治疗仍然是一个难题，人们应用的主要的治疗手段仍然是手术，放疗和化疗，传统的治疗法在带来疗效的同时，副作用也往往很大，并且对于复发的肿瘤治疗效果更加有限。传统的疗法的缺点主要在于其在杀死肿瘤细胞的同时也大量地杀死了正常细胞，导向治疗的出现使我们有可能对肿瘤细胞实现导向治疗，即药品分子可以导向地到达肿瘤细胞并发挥作用，达到导向治疗的效果。目前免疫毒素或导向毒素是达到导向治疗的一个重要的发展方向，通过特异性抗体或细胞因子、激素等与毒素连接，前者作为导向部分，即配体，可以引导分子到达肿瘤部位并与肿瘤细胞表面的过量表达的该种受体结合，后者作为毒素部分，即杀灭肿瘤细胞的部分。目前以GnRH或其衍生物为导向部分，以PE毒素的截短形式PE40及PE40衍生物为毒素部分的靶向治疗剂已经有报道(中国专利：应用嵌合毒素诊断癌症的方法，99806580.3；中国专利：一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白，03137587.1；中国专利：高效低毒的系列功能蛋白，200410033621.6)，这些融合蛋白的靶向型已得到广泛验证，能特异性地识别目的细胞并将其杀死，但目前在应用中还存在一个很大的问题，那就是由于实体瘤的结构问题，目前的靶向毒性蛋白中PE衍生物对于动物模型中生长旺盛的实体瘤起效不大，于是如何增强靶向毒性蛋白中PE部分的细胞毒性就成了一个急待解决的问题。

三.发明内容：

本发明涉及一种GnRH-PE衍生物，为了进一步提高靶向融合蛋白的生物活性，增强其对生长旺盛的肿瘤细胞的杀伤力，从而更好地将靶向融合蛋白应用于治疗领域，本发明人通过对已知GnRH-PE融合蛋白进行蛋白质三级结构分析，结合文献，采用基因工程方法对所述融合蛋白的毒素部分进行缺失和突变，通过大量的筛选，获得了在活性方面明显优于现有GnRH-PE衍生物的新的GnRH-PE衍生物。

本发明中的GnRH-PE衍生物包括将PE40的359-365位氨基酸进行了缺失(即为PE39)，并将PE40的末端5个氨基酸REDLK突变为KDEL，最终我们得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL。

通过上述发明得到的靶向融合蛋白具有高活性的特点，对肿瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用，是潜在的肿瘤治疗药物。

本发明的一个方面，涉及一种GnRH-PE衍生物GnRH-PE39KDEL，为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。