[发明专利]疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗及其制备和施用方法，且特别涉及用于水生动物的纳米化 疫苗、其制备方法及施用方法。

背景技术

病毒性神经坏死症(Viral nervous necrosis disease，VNN disease)是近年来普 遍发生在海水养殖鱼类的病毒性疾病，首次发生在日本，随后发生在世界各地， 除了非洲之外，其他各洲都有案例，是一种全球性的鱼类病毒性疾病，造成此 疾病的病毒称为神经坏死症病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，或称为鱼类结病 毒(Fish nodavirus or Beta-nodavirus)。

神经坏死症病毒为单股RNA病毒，不具外套膜、外型为二十面体、直径约 25～34nm的病毒颗粒。罹病初期的鱼苗会有突发性的游动，体色变黑，失去平 衡能力，及回旋打转、螺旋游泳等不正常游泳行为，部分鱼只有身体侧弯、体 色变黑，有时会侧躺漂浮在水面，虚弱的鱼苗先是浮在水面，最后沈入池底死 亡；在出现病症后的一周内即会发生大量死亡的情形(Yoshikoshi，Inoue，1990； Glazebrook et al.，1990；Bloch et al.，1991；Renault et al.，1991)。

随着养殖技术的进步，传统粗放式养殖逐渐转型发展到今日高密度集约式 养殖。目前世界上从事水产养殖业的国家大多采取高密度集约式养殖，此方式 虽能大幅度提高单位面积的生产能力，但也造成了许多问题，特别是养殖过程 中因管理不当而引起的疾病爆发。

现今的防治方法主要为药物处理，例如，以氯、碘、铵或臭氧对用具、鱼 卵、水及饵料进行消毒，但在解决鱼类病毒性疾病中，除了环境的消毒及增加 鱼体免疫力外，疫苗的开发也非常重要，且台湾及许多鱼苗养殖国家每年都有 病毒性神经坏死症(VNN)爆发，造成经济严重损失，因此发展有效的神经坏死病 毒疫苗成为防疫工作的首要项目。

发明内容

本发明的目的是提供一种疫苗的制备方法及施用方法。本发明的疫苗制备 方法可制备出颗粒大小在20至500nm之间的纳米化疫苗，保护效果在60％相 对存活率(relative percentage survival，RPS)以上的疫苗。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括：

一种制备疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)利用细胞株培养 病毒，以获得含有所述的病毒的上清液；(b)将所述的上清液以去活化药剂处 理，得到去活化疫苗；以及(c)将所述的去活化疫苗经纳米化包埋程序，形成 纳米化包埋的去活化疫苗。

优选的实施方案中，所述的纳米化去活化疫苗的大小在20至500nm之间。

优选的实施方案中，所述的细胞株为所有对NNV具感受性的鱼类细胞株。

优选的实施方案中，所述的细胞株是GF-1、SSN-1、E-11、GB3、GF、GL、 SISE、GS、SAF1或GL-av。

优选的实施方案中，所述的病毒是自所有罹患神经坏死症鱼体分离出来的 NNV分离株的任意一种。

优选的实施方案中，所述的病毒是RGNNV、SJNNV、TPNNV、BFNNV、 FEV、DGNNV、GGNNV、G9410YA、G9508KS或HG00GD。

优选的实施方案中，所述的去活化药剂是0.1-0.2％体积比的甲醛水溶液或 2-溴乙胺(binary ethyleneimine)。

优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗的病毒浓度在10⁵TCID50/ml 以上。

优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗的保护效果(relative percentage survival，RPS)为60％以上。

优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗为浸泡式疫苗，以浸泡的方式 进行免疫。

优选的实施方案中，所述的浸泡的时间为30至60分钟之间。

优选的实施方案中，所述的纳米去活化疫苗用于免疫水生动物。

优选的实施方案中，所述的水生动物是鱼类、虾类或蟹类。