[发明专利]一种鉴定微生物肥料中沼泽红假单胞菌的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及利用适当的引物通过PCR反应，检测微生物肥料中沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris(Molish)van Niel)的方法，以及在该方法中所用的引物。

技术背景

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是地球上最早出现的一大类能以光作为能源，以CO2和有机物作为光合作用碳源，以有机物、氢气或硫化物为供氢体而营养繁殖的原核生物的总称。它广泛分布在海洋、河川、沼泽、水沟、活性污泥、土壤、极地、温泉和高盐水体等各种生境中。光合细菌因具有复杂多样的代谢功能、丰富的营养及生理活性物质等特性，使之在种植业、养殖业以及环境废水处理等方面得到了广泛应用。以光合细菌为菌种生产的微生物肥料产品在水稻、蔬菜、果树和烟草等作物上都取得了较好效果，研究表明光合细菌具有改善土壤的结构和营养状况、提高土壤肥力、增强作物抗病防病能力、提高作物的光合作用能力、提高作物品质等等方面功效。

鉴于光合细菌多功能性，人们希望将其应用于微生物肥料以提高肥效。为确保含光合细菌的微生物肥料产品的使用效果，需要明确肥料产品中的光合细菌的种类和质量。因而需要一种使用简便，结果准确的质量检测技术应用于产品质量监督环节。目前使用的传统光合细菌菌种鉴定是以形态特征和各项生理生化方法为主，操作步骤烦琐，检测时间较长，并且特异性差。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的光合细菌检测新方法，以满足光合细菌产品的质量检测的准确性和时效性。

PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，已经在医学和卫生检测方面得到了广泛的应用，有报道称目前已对多种病毒和病源菌，例如乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等建立了基于PCR技术的检测方法。为将PCR技术应用于微生物肥料检测领域，本发明人通过反复摸索实践建立了一种基于PCR技术的、快速、准确、灵敏地检测微生物肥料生产中常用的光合细菌的方法。该方法特别适用于沼泽红假单胞菌的鉴定。本发明是通过下述的技术方案实现的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用特异引物PCR技术对微生物肥料中常见的光合细菌进行鉴定的方法。在本发明的一个优选的实施方案中提供了通过特异引物PCR技术鉴定沼泽红假单胞菌和其产品菌种的鉴定方法。在进一步优选的实施方案中，所述的沼泽红假单胞菌纯菌种。本发明的另一目的在于提供上述鉴定方法中所用的特异引物。

具体而言，本发明基于已知的沼泽红假单胞菌16S rDNA核酸序列，设计了上述菌种的特异引物。通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了沼泽红假单胞菌的PCR鉴定方法，用于检测微生物肥料中光合细菌产品的沼泽红假单胞菌。

本专利发明的鉴定沼泽红假单胞菌的PCR方法为：

上游引物1：5’-GCGGGAAGATAATGACGGT；

下游引物2：5’TGGTAGCAACTAAGGACGG.

PCR反应体系1：10×buffer    2μL

dNTPs(10mmol/L)             1.6μL

引物1(10μmol/L)            0.5μL

引物2(10μmol/L)            0.5μL

Taq E(2.5U/μL)             0.2μL

模板DNA                     2.0μL

镁离子(25mmol/L)            0.8μL

补足ddH₂O                   20μL

PCR扩增参数1：95℃    5min

72℃                  30s

72℃                  10min

附图说明

图1为应用沼泽红假单胞菌特异引物对标准菌株进行PCR的实验结果(照片)如所示。其中，各泳道的具体说明如下：

泳道1：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillu polymyxa)

泳道2：短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)

泳道3：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

泳道4：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)