[发明专利]一种用于剔除筛选标记基因的植物双元表达系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种可除去筛选标记基因的双元表达载体系统及其在培育安全性转基因植物中的应用。

背景技术

筛选标记基因在植物基因工程中具有重要作用，利用筛选标记基因可以在植物转基因过程中从大量未转化的细胞中筛选出转化细胞。然而，转基因植物中的筛选基因又引起了人们对一系列生物安全方面的担心，如选择标记基因是否编码有毒的物质和过敏源，是否不利于植物代谢的改变，是否会降低治疗性药物的疗效，以及是否会在相近的物种和病原体间迁移等。如何从转基因植物中剔除筛选标记基因已经成为人们关心的问题。目前，主要有两种具有潜在的应用价值的剔除筛选标记基因的技术：一种是目的基因和筛选标记基因共转化技术，它可以使目的基因和筛选标记基因通过基因自由分离的原则在后代中剔除筛选标记基因而保留目的基因；另一种是通过位点特异性重组来剪除筛选标记基因的技术。此外，还有转座子介导的筛选标记基因剔除技术和同源重组介导的筛选标记基因剔除技术等。但这些方法存在着获得共转化植株及剔除筛选标记基因的效率较低的缺点。因此，建立一个高效剔除筛选标记基因的系统已成为把转基因植物迅速推广市场的必要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种剔除筛选标记基因的植物双元表达系统。

本发明的植物双元表达系统由目的基因表达载体和筛选标记基因载体两个植物表达载体组成，其中所述的目的基因表达载体包括启动子及其下游的转录激活因子基因，以及一个多克隆位点(MCS)；所述的筛选标记基因载体包括所述转录激活因子识别的顺式作用元件(UAS)及其下游的筛选标记基因。

上述的转录激活因子可以是具有与Gal4相同或相似功能的所有具有DNA结合结构域与转录激活结构域的转录激活因子，例如酵母的HAP1，酵母的Gal4，噬菌体的434:VP16，大肠杆菌的LexA，HIV的tat等，优选为HAP1和Gal4，尤其优选为融合蛋白HAP1-VP16和Gal4(BDB)-VP16。所述转录激活因子不但具有结合顺式作用元件UAS的功能，而且还具有激活UAS下游基因的功能。

在本发明的一个具体实施例中，所述转录激活因子是融合蛋白HAP1-VP16，为HAP1基因的DNA结合区与HAP1基因的转录增强区融合蛋白；所述顺式作用元件为UAS-HAP1，其在正常情况下不能启动下游基因的表达，但与融合蛋白HAP1-VP16结合后对下游基因具有很强的启动作用。

上述转录激活因子基因上游的启动子为任一在植物中起作用的启动子，包括组成型、诱导型或组织特异性表达启动子，如花椰菜花叶病毒35S核糖体蛋白启动子(CaMV35S启动子)、Actin1启动子等。

上述的筛选标记基因为可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(潮霉素磷酸转移酶基因hpt、庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述目的基因表达载体可以在多克隆位点处插入一个或多个目的基因，在目的基因的上游带有其自身所需的启动子，或者融合有上述转录激活因子识别的顺式作用元件。

本发明的第二个目的是提供一种剔除筛选标记基因的植物转化方法，使目的基因和筛选标记基因通过基因自由分离的原则在转基因植物后代中剔除筛选标记基因而保留目的基因。

本发明所提供的剔除筛选标记基因的植物转化方法，包括以下步骤：

1)构建上述植物双元表达系统，将目的基因克隆到上述目的基因表达载体的多克隆位点中；

2)用所述目的基因表达载体和筛选标记基因载体共转化植物，通过是否表达筛选标记基因筛选出共转化的转基因植株；

3)对共转化的转基因植株的后代进行扩繁，筛选出不含有筛选标记基因而保留目的基因的转基因植株后代。

在上述步骤2)的共转化植株中，目的基因表达载体表达的转录激活因子与筛选标记基因载体上的顺式作用元件相结合，从而激活筛选标记基因的表达，达到对转基因植物进行筛选的目的。

上述步骤3)在转基因植物后代中由于减数分裂的作用，转录激活因子与有顺式作用元件及其下游的筛选标记基因发生分离，从而可获得不含有筛选标记基因的转基因植株。

用于构建所述植物双元表达系统中植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121等。