[发明专利]一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种用于治疗肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂，所述的细胞制剂包含 肝细胞样细胞和PBS溶液，所述肝细胞样细胞是由胎盘、脐带来源的组织 干细胞制剂经体外诱导培养而成，所述胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂 是由从胎盘、脐带分离得到的组织干细胞制成的细胞制剂，其特征在于， 所述细胞呈成纤维细胞样贴壁生长，该细胞群表达阳性率≥50％OCT3/4， SSEA-4，CD13，CD73、CD105，不表达或低表达阳性率≤2％CD34，CD45， CD117，CD133，CD31，vWF，FLK-1以及HLA-DR，所述细胞制剂的肝细胞 样细胞浓度为每毫升0.5-2×10⁷个细胞。

2.权利要求1所述的一种用于治疗肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂的制 备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从胎盘和脐带中将组织干细胞分离纯化、培养，制成细胞悬液， 得到胎盘、脐带来源的组织干细胞；

(2)将步骤(1)中的组织干细胞在体外诱导，分化成肝细胞样细胞；

(3)将步骤(2)中的肝细胞样细胞用无菌PBS缓冲溶液稀释，制成 细胞制剂；

所述步骤(1)具体包括以下步骤：

第一，将脐带和胎盘机械剪切成1mm³小组织块，采用浓度为1mg/mL 胶原酶I在37℃消化1小时，再用浓度为0.25％胰酶37℃消化30分钟，期 间温和震荡；

第二，加胎牛血清中和胰酶后将组织悬液通过细胞筛，离心收集细胞 悬液；

第三，将所得细胞悬液接种于包被4μg/cm²纤连蛋白的T75cm²培养瓶 中，在添加了10ng/mL表皮生长因子的D/F12+10％胎牛血清体系中培养5 到7天；

第四，将得到的呈成纤维样细胞的组织干细胞再消化传代纯化、扩增， 浓缩成单个核细胞混悬液，得到胎盘、脐带来源的组织干细胞；

所述步骤(2)具体包括以下步骤：

第一，取5-10代分离的组织干细胞，采用D/F12培养体系，血清饥饿 24小时；

第二，第一阶段培养采用IMDM补充20ng/mL肝细胞生长因子和 10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子，nicotinamide 20ng/L培养体系持续14 天；

第三，第二阶段处理IMDM加入20ng/mL oncostatin M，1μmol/L  dexamethasone，and 50mg/mL ITS+premix培养体系持续14天，每周换液两 次。