[发明专利]猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种白介素-12的应用，具体涉及一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法。

背景技术

迄今为止，许多传染性疾病尚未得到有效防治，现行的灭活疫苗或弱毒疫苗等传统疫苗或免疫效力低下，或存在安全性问题，促使人们开发安全有效的新型疫苗。基于重组DNA技术的基因工程疫苗安全可靠、易于鉴别诊断，具有很大的应用前景，但其抗原性一般较弱，需要有效的免疫佐剂以增强其保护效力。

发明内容

本发明的目的在于针对pIL-12在猪各种疾病中的免疫调节作用，以及开发治疗免疫功能紊乱的免疫调节剂及某些炎性疾病的抗炎防治剂，提供了一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法。

本发明的技术方案为：一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂，pIL-12包括两个亚基的编码基因p35和p40，p35编码基因大小为720bp，p40为1044bp，分别编码223个氨基酸和325个氨基酸的多肽。

一种猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂的制备方法，从LPS活化的猪外周血单个核细胞(PBMC)提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出pIL-12两个亚基的编码基因p35和p40，然后将p35基因和p40基因分别亚克隆到原核表达载体pET30c、pET30b中，克隆pIL-12基因。

优选的是，所述的RNA的提取过程为：从猪前腔静脉采血，然后用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI1640培养基进行培养，并加LPS于细胞培养液，分别取诱导2小时和12小时的细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA。

优选的是，所述的RPMI1640培养基含有10U/ml青霉素、10U/ml链霉素和10％胎牛血清。

优选的是，所述的RT-PCR方法为：分别取诱导2小时和12小时的细胞所提取的总RNA，加入适量下游引物P2、P4，然后分别加入dNTP、10×buffer、RNasin、AMV反转录酶，再加入适量的Ex.Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，组成2个反转录扩增体系，合成p35和p40的PCR产物p35 cDNA和p40 cDNA。扩增结束后取5μL混合物，利用2％琼脂糖凝胶进行电泳。将p35和p40的PCR产物分别用BamHI和EcoRI酶切鉴定。

优选的是，所述的扩增体系包括p35扩增体系和p40扩增体系，p35扩增体系的反应条件为：预加热95℃ 5min，然后94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸10min；p40扩增体系及反应条件与p35相似，不同之处是退火温度为56℃。

优选的是，所述的克隆pIL-12基因的过程为：取SacI和SalI酶切处理的原核表达载体pET30c、pET30b和p35或p40的PCR产物，分别加入T₄ DNA连接酶和10×buffer，组成两个连接反应体系，16℃进行12小时连接反应，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性菌落，提取质粒。

优选的是，所述的克隆的鉴定为：将提取的质粒用PCR和SacI、SalI双酶切进行鉴定并筛选阳性克隆。

本发明的有益效果为：白细胞介素-12(IL-12)又名NK细胞刺激因子(NKSF)或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)，能诱导T细胞和NK细胞产生IFN-γ，并增强其细胞毒活性，它的关键作用是能诱导Th0细胞分化为Th1细胞以激发细胞免疫进程。IL-12是启动保护性细胞免疫的有效佐剂，在调节机体非特异性和特异性免疫方面具有重要作用，其调节方式主要通过刺激NK细胞和细胞毒淋巴细胞来完成。IL-12能调节免疫反应的方向，这为细胞因子佐剂应用于灭活疫苗提供了理论基础。按预期反应类型来调节保护性免疫，即调控疫苗诱导的免疫反应，使之朝细胞免疫为主的方向发展而不是体液免疫为主的方向发展，这在开发以细胞免疫为主的感染性疾病的有效疫苗方面很有意义。

附图说明

图1为本发明具体实施例p35/pET30c的构建示意图；

图2为本发明具体实施例p40/pET30b的构建示意图；

图3为本发明具体实施例P35亚基的基因序列及预测蛋白的氨基酸序列图；

图4为本发明具体实施例P40亚基的基因序列及预测蛋白的氨基酸序列图。

具体实施方式