[发明专利]人谷胱苷肽－S－转移酶pi在制备治疗全身炎症药物中的应用

说明书

本申请是申请号200610040269.8，原申请日2006年5月12日，新申请日2006年7月19日，发明名称为“人谷胱苷肽-S-转移酶pi的纯化方法及其该酶的应用”，的分案申请。

一、技术领域

本发明涉及人谷胱苷肽-S-转移酶pi的新用途，具体涉及采用His-tag重组蛋白纯化技术纯化的人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症药物中的应用。

二、背景技术

1985年，Coris首先提出全身炎症反应综合征(systemic inflammationresponse syndrome，SIRS)是由不同疾病，包括微生物感染、创伤、烧伤等感染性疾病所引起的全身性的非特异性炎症反应，最终导致机体对炎症反应的失控。根据临床表现分为全身感染或脓毒症、败血症综合征、早期感染性休克、难治性感染性休克、多器官功能障碍综合征以及死亡6期。最近的临床资料表明，革兰氏杆菌所致全身炎症反应综合征的主要死亡原因是内毒素的作用。

SIRS是一动态发展、连续的过程，治疗得当可使病情早期得到控制，避免其进一步发展。目前临床治疗措施有：1、抗介质制剂治疗。目前国外已将包括单克隆肿瘤坏死因子(TNF-α)抗体、重组人类白介素-1受体拮抗剂、TNF受体、内毒素单克隆抗体等抗炎介质应用于临床。2、CRRT治疗。通过体外循环清除血液中的代谢产物、内源性抗体、异常血浆成分及蓄积体内的药物或毒物。3、核因子-κB(NF-κB)抑制剂治疗。NF-κB抑制剂有糖皮质激素、IL-10等，糖皮质激素通过活化的糖皮质激素受体与调节它们表达的转录子结合而抑制炎症基因的表达；而IL-10可抑制与辅助T淋巴细胞1(Th1)反应相关的许多细胞因子基因的转录。4、基因治疗。利用脂质体转基因技术制成病毒疫苗传递某些必要的基因，可对抗过强的炎症反应，现已成功地给实验动物转入抗炎因子基因IL-4、IL-10，抗氧化剂和抗蛋白酶等基因调节免疫应答，增强细胞的反应性、耐受性。

目前的抗炎药物一定程度上都存在缺陷，很多药物抗炎疗效并不理想或不良反应较大，在减轻组织炎症损伤的同时亦削弱了机体免疫力，不利于炎症的治疗。提高抗炎药物的疗效和降低药物对机体正常免疫力的影响是各国科学家一直不断努力的研究目标。

1961年，Boouh首先发现了谷胱苷肽-S-转移酶(GST)，该酶是由2个同源酶二聚体亚基组成的一个超基因家族，有α、μ、pi 3种，在体内主要催化外源性和内源性亲电子有毒物质与谷胱苷肽结合，形成亲水性强的物质而起到解毒作用。目前研究最多的是pi亚型，已有研究表明谷胱苷肽-S-转移酶pi(GSTpi)与肿瘤的耐药性/肿瘤的发生发展有密切关系。目前尚未发现GSTpi在抗炎方面的应用。另外，未见应用重组蛋白纯化技术表达、纯化GSTpi的相关报道。

三、发明内容

1、发明目的

本发明的目的是提供一种人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制药中的新用途，即提供一种人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合症以及由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。

2、技术方案

本发明为人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗全身炎症反应综合征疾病药物中的应用。

本发明为人谷胱苷肽-S-转移酶pi在制备治疗由革兰氏杆菌引起炎症性疾病药物中的应用。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用重组蛋白纯化技术得到人谷胱苷肽-S-转移酶pi(GSTpi)的方法以及GSTpi的药理药效试验的结果来说明其在制药领域中的新用途。

(1)人谷胱苷肽-S-转移酶pi的表达纯化方法：

方法一、

第一步：将含表达载体pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接种于含卡那霉素100mg/L的LB固体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，用去离子水定容至1升，37℃振荡培养12h，挑单菌落接种于含卡那霉素100mg/L LB液体培养基，每升培养基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去离子水定容至1升，37℃振摇培养16h，然后取1mL接种到100mL LB液体培养基，37℃振摇培养2～4h，OD₆₀₀达到0.5～0.6时，加异丙基β-半乳糖苷至终浓度为0.4mM，继续振摇培养4h，12,500g离心10min收集菌体；