[发明专利]促创伤愈合因子的纯化与应用

权利要求书

1.一种从含有促创伤愈合因子的来源如血液中制备含有纯化的促 创伤愈合因子之组合物的方法，所述促创伤愈合因子选自:肝细胞生长 因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、 转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、胰岛素样生长 因子(IGF-I)和成纤维细胞生长因子(FGF)，其中所述制备方法包括 在抗凝血酶III(AT-III)存在下实施的纯化步骤。

2.权利要求1的方法，其包括如下步骤:

(i)将冷冻血液解冻，最终除去沉淀并进一步处理上清液；

(ii)使上清液在阴离子交换色谱所需缓冲溶液中与阴离子交换色 谱材料接触，所述缓冲液中的盐浓度与生理条件相当，其pH值约为中 性；

(iii)将所述阴离子交换色谱材料分离出去，得到溶液；

(iv)使所述溶液与肝素-亲和色谱材料接触；

(v)分离出所述溶液，用解吸缓冲液处理肝素-亲和色谱材料，所 述缓冲液具有足以允许所述促创伤愈合因子从所述肝素-亲和色谱材料 上解吸下来的离子强度；

(vi)收集包含所述促创伤愈合因子、AT-III和HRGP的所述解吸 缓冲液。

3.权利要求1的方法，其包括如下步骤:

(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液；

(ii)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的时 间使之与不想要的物质结合；

(iii)加入低级脂肪醇，如C₁-C₄醇，以形成科恩级分I；

(iv)除去无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；

(v)使科恩级分I上清液通过亲和色谱材料来对其进行处理，由此 使所述促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而其它血浆 蛋白未结合并被除去；

(vi)从亲和色谱材料上洗脱并收集所述促创伤愈合因子。

4.权利要求1的方法，其包括如下步骤:

(i)将冷冻血浆解冻，任选地除去沉淀并进一步处理上清液；

(ii)使上清液在阴离子交换色谱所需缓冲液中与阴离子交换色谱材 料接触，所述缓冲液盐的浓度与生理条件相当，其pH值约中性，大部分 的蛋白质(包括所述促创伤愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转 铁蛋白、触珠蛋白等)未结合，但是一些特定蛋白和蛋白酶结合在阴离子 树脂上(例如:凝血酶原，FX，FIX等)；

(iii)将所述阴离子色谱材料分离出去，得到溶液(包含促创伤愈 合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)；

(iv)加入无机吸附材料，如硅藻土、硅胶、氧化铝，孵育足够的 时间使之与不想要的物质结合，如:FXII和激肽释放酶原激活剂等；

(v)加入低级脂肪醇，如C₁-C₄醇，以形成科恩级分I；

(vi)除去无机吸附材料，以及，如果沉淀存在，还除去沉淀；

(vii)使科恩级分I上清液通过亲和色谱材料来对其进行处理，由此 使促创伤愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)结合，而大部分其它血浆蛋 白(如白蛋白、IgG、转铁蛋白、触珠蛋白等)未结合并被除去；

(viii)从亲和色谱材料上洗脱并收集含有所述促创伤愈合因子的物 质(任选地，在促创伤愈合因子级分解吸前用清洗缓冲液处理亲和树脂， 所述清洗液具有提高的离子强度，足以使杂质蛋白解吸，但是尚不能使所 述促创伤愈合因子级分解吸)。