[发明专利]同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰

说明书

本发明涉及用于兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属 (Bacillus)物种的工业应用的遗传修饰。

乳酸及其盐(称为乳酸盐)是市售可得的产品，其可用于各种领 域，包括医药、生物可降解聚合物和食品加工。兼性厌氧且同型乳酸 的中度嗜热芽孢杆菌属物种是用于乳酸的工业制备的理想生物。它们 能够在30-65℃的温度下生长，并在高于50℃的温度下允许厌氧工业 发酵。当以工业规模进行发酵时，该高温度具有几个优点：低感染风 险并因此更高的对映异构体纯度，更快的反应等等。同型乳酸性质允 许从烃来源(包括六糖和五糖；参见WO 04/063382)生产乳酸，而不 形成多于15wt％的副产物，例如甲酸和乙酸。所述芽孢杆菌的兼性 厌氧性质允许在厌氧条件下进行发酵，或者至少在低氧气分压下进行 发酵，由于这允许相对便宜的设备和工艺，所以这对于工业规模来说 是所需要的。此外，这些细菌的营养要求比乳酸细菌例如乳杆菌属 (Lactobacillus)物种低，所述乳酸细菌也允许相对便宜的工业工艺。 已知的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌的一个缺点是，它们 不或者几乎不产生R-乳酸。由于生物可降解乳酸聚合物的成功应用依 赖于便宜的S-乳酸和便宜的R-乳酸两者的可用性，因此需要这两种对 映异构体的有成本效益的生产。如今，已知的产R-乳酸的细菌是嗜热 的(例如左旋乳酸芽孢杆菌(Bacillus laevolacticus)或者具有苛 求的营养要求(例如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii))， 这使得R-乳酸的制备比S-乳酸的制备要贵得多。

因此，本发明的一个目的是利用中度嗜热芽孢杆菌菌株，其是兼 性厌氧的并且通过同型乳酸发酵来生产R-乳酸。本发明的另一个目的 是利用用于产生经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆 菌的方法。

芽孢杆菌属包括超过200个不同的物种(参见Sneath，P.H.A.， 1986：Endospore-forming Gram-positive rods and cocci.Bergey’s manual of systematic bacteriology.Vol 2.Sneath，P.H.A.，Mair， N.S.，Sharpe，M.E.，Holt，J.G.(编辑)Williams & Wilkins， Baltimore)。已知这些芽孢杆菌只有少部分是遗传上可了解的。例如， 原生质体转化对于许多不同的芽孢杆菌属物种发挥作用，但仅证明感 受态细胞的转化通常对于严格需氧的且嗜温的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)168的细胞的作用是令人满意的。工业菌株常 常对于遗传修饰更具有抗性，如从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中所获知的。将这种兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌属 物种用于酶的工业生产。然而，因为其异型乳酸性质，其不能用于乳 酸的生产(参见Bulthuis，B.A.，C.Rommens，G.M.Koningstein， A.H.Stouthamer，H.W.van Verseveld，1991：Formation offermentation products and extracellular protease duringanaerobic growth of Bacillus licheniformis in chemostat andbatch-culture，Antonie van Leeuwenhoek 60：355-371)。通常， 高频率的感受态转化操作不可用于工业菌株(参见Outtrup，H.和S.T. 2002：The importance of Bacillus species in theproduction of industrial enzymes in Applications andsystematics of Bacillus and relatives.R.Berkeley，M. Heyndrickx，N.Logan，和P.de Vos(eds.)，pp.206-218，Blackwell Publishing，Malden，USA)。可通过原生质体转化来修饰这样的菌株， 如US 6,083,718中所公开的。