[发明专利]重组微生物

说明书

技术领域

本发明涉及在纤维素酶的生产中使用的重组微生物和使用该重组微生物的纤维素酶制造方法。 

背景技术

纤维素是植物细胞壁的主要成分，其为有效地利用在衣料、纸张、建筑材料等中的生物质中的具有代表性的成分。另外，作为生物质的有效利用方法，一直以来尝试使用分解纤维素的酶转换为糖类、或进一步转换为能量物质的方法。另外，在由掘越发现来自嗜碱性杆菌属细菌的碱性纤维素酶以来(例如，参照专利文献1、非专利文献1)，一直难以实现的将纤维素酶应用在衣料用重质洗涤剂成为可能，实现嗜碱性杆菌属细菌生产的碱性纤维素酶向衣料用洗涤剂中的配合(例如，参照专利文献2～4)。 

近年，随着基因工程的发展，由微生物产生的有用物质的工业化生产正在扩大，洗涤剂用酶的生产也由基因重组向大量生产发展。在这种由微生物产生的有用物质的工业生产中，提高其生产率是重要课题之一。作为解决该课题的方法，正在进展由突变等遗传学方法进行的生产菌的育种、适合基因重组的宿主微生物的开发。 

另一方面，在以枯草杆菌为首的芽孢杆菌(Bacillus)属细菌和包括这些菌的革兰氏阳性菌、进而在大肠菌等革兰氏阴性菌中，细胞内合成的蛋白质(未成熟的分泌蛋白质)向细胞外的输送主要经过称为Sec通路的运输系统进行。枯草杆菌中的Sec通路通过承担将分泌蛋白质向细胞外挤出的马达作用的SecA、另外的构成分泌蛋白质通过的输送通道的主要部分的SecY、SecE、SecG 3种蛋白质、此外的作为输送通道辅助因子的SecDF等，承担其功能。 

其中，关于能够过量表达编码SecG蛋白质的secG基因的表达载体(专利文献5)、通过改变secG基因的核糖体结合部位而改变secG基因的表达的革兰氏阳性菌(专利文献6)已经有报告，报告显示，在异种蛋白质生产时，破坏了secG基因的枯草杆菌的生长发育受到阻碍等。还有报告，在大肠菌中，secY基因的突变阻碍在低温下的生长发育和蛋白质分泌(非专利文献2)。

但是，至今尚没有报告显示通过secG基因、secY基因在活菌内过量表达来提高目的蛋白质的分泌生产率的数据，另外，关于其它的Sec通路相关基因的过量表达对目的蛋白质的分泌生产带来怎样的影响，至今也没有得到充分的见解。 

专利文献1：日本特公昭50-28515号公报 

专利文献2：日本特公昭60-23158号公报 

专利文献3：日本特公平6-030578号公报 

专利文献4：美国专利第4945053号公报 

专利文献5：日本特表2001-510046号公报 

专利文献6：美国专利申请公开第2003/0157642号说明书 

非专利文献1：Horikoshi & Akiba，Alkalophilic Microorganisms，Springer，Berlin(1982) 

非专利文献2：Cell，32，：789(1983) 

发明内容

本发明涉及一种重组微生物，其中，在进行基因构建，使枯草杆菌secY基因或相当于该基因的基因过量表达而获得的微生物中，导入编码纤维素酶的基因。 

另外，本发明涉及一种使用该重组微生物的纤维素酶的制造方法。 

附图说明

图1是示意地表示使用通过SOE-PCR法调制的结合核酸片段的基因导入的图。 

图2是示意地表示通过SOE-PCR法调制连接有spoVG基因的转录起始控制区域和核糖体结合区域的secY基因导入用DNA片段、以及使用该DNA片段将基因导入染色体中的方法的一个例子的图。 

图3是示意地表示通过SOE-PCR法调制基因导入用DNA片段以及使用该DNA片段将基因导入染色体中的方法的一个例子的图，其中，该基因导入用DNA片段在secY基因下游连接有secE基因，使得secE基因与导入amyE基因部位的secY基因共同被转录。