[发明专利]用于核酸扩增的基质

说明书

发明领域

本发明涉及用于核酸扩增包含多孔基质的方法、基质、试剂盒和系统，所述多孔基质具有使得生物分子能够扩散的孔。

发明背景

核酸的扩增是基于核酸分析的几乎所有诊断或分析测试的基本部分。因为目的核酸通常仅以非常小的浓度存在，所以这些测试包含至少一个扩增步骤，以产生可检测量的核酸分子。需要选择性结合2种寡核苷酸引物的众所周知的测定是在US 4,683,195中描述的聚合酶链反应(PCR)。这种方法允许在脱氧核苷酸三磷酸的存在下在几个循环中经由耐热的聚合酶将特定核酸区域选择性扩增至可检测水平。

因为通量以及成本不仅对于工业而且对于科学应用都具有重要性，所以存在关于基于PCR的测试的并行化和小型化的高度需求。用于PCR扩增的并行化的众所周知方法是多孔板的使用，所述多孔板可以通过使用加热块(thermal block)整体暴露于温度循环。此处，可能直接在多孔板内(例如通过荧光)或通过使用例如凝胶电泳或质谱分析法外部分析PCR结果。此种多孔板允许平行的几百次反应，每个具有几μl的反应体积。在具有最高达1536个孔的多孔板中用于PCR扩增的系统从几个公司商购可得。

最近，在固体支持体中具有各仅有50nl体积的最高达10,000个均匀分布的孔的特殊支持体是可用的(Brenan等人，Proc.SPIE，第4626卷，第560-569页)，以平行执行数千不同PCR应用。但是当然，具有通孔的此种支持体的生产、液体处理、蒸发和邻近孔之间的交叉污染在此种系统中是苛求的。

Applied Biosystems Inc.(Foster City，CA/USA)引入微观流体卡，其使得用户能够在一次性使用的塑料中执行最高达8个样品的PCR反应，其中每种样品48次不同PCR测定。引物和水解探针进行预合成、点样到不同孔内且其后进行干燥。对于实验，用户必须将包括样品的PCR主混合物移液到1个孔内，用封口箔将卡密封且使卡离心，从而使得PCR混合物可以在PCR反应发生前通过通道系统扩散到不同孔内。

Fluidigm(San Francicso，CA/USA)已开发了具有纳米流体(nanofluidic)芯片用于实时PCR的系统，用于组合48种样品和48次测定，总共2.304次实验。纳米流体芯片装载样品、引物和FRET探针组后，仪器配置自动将样品和测定组合成在不连续的10nl反应室内的所有可能的配对。

发明概述

考虑到现有技术，本发明涉及用于核酸扩增的方法、基质、试剂盒和系统，由此所述核酸扩增在多孔基质的孔内发生。

本发明的一个方面是用于核酸扩增的方法，其包括

a)提供进行构造以提供区室的多孔基质，

b)向所述多孔基质中加入包含核酸的样品和扩增混合物，

c)使所述多孔基质暴露于温度循环，

其中所述核酸扩增在所述多孔基质的孔内发生。

在本发明自始至终，核酸扩增概括了本领域技术人员已知的所有种类的扩增程序，例如US 4,683,195中描述的聚合酶链反应(PCR)。其他可能的扩增反应是连接酶链反应(LCR，Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569和Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链反应(Barany，PCR Methods andApplic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(PCT专利公开号WO 90/01069)；修复链反应(欧洲专利公开号439 182 A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；PCT专利公开号WO92/08800)和NASBA(美国专利号5,130,238)。此外，存在链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和Qβ-扩增(关于综述参见例如Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson；R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion inBiotechnology 4(1993)41-47)。