[发明专利]基于测序的高通量SNPs连接检测技术

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域。特别地，本发明涉及核酸检测领域，更特别地，在于可用于高通量核酸检测的探针的设计和组合(集合)。本发明也涉及到用探针和探针组合检测核酸的方法。本发明进一步提供了可与目的基因的靶序列杂交的探针和连接探针的扩增引物，这些探针和引物在鉴定和/或检测与各种各样的遗传性状和基因有关系的核苷酸序列的用途，适用于本发明的方法中使用的探针和引物的试剂盒。无论是人工合成的、植物、动物或人类来源的或以上的组合的靶核苷酸序列的高通量检测都适用于本发明。特别适用于高通量检测基因分型领域。

背景技术

人们对于检测特定核酸序列的兴趣迅速增长。自从人类基因组核苷酸序列草图和许多其他基因组草图问世，以及人类和许多其他生物体基因组草图中大量单核苷酸多态性(SNP)和小的插入/缺失多态性(indel)的发现，人们开始对核酸测定产生兴趣。而标记技术(如AFLP)、SNPWave技术和一般的检测与特定核酸序列相关性的识别技术可检测作为遗传性疾病特征的特异核酸序列，如检测乳腺癌基因brca1的各种等位基因以筛选乳腺癌的易感性。这些技术的出现使人们对于核酸测定更加感兴趣。由于认识到基因中单核苷酸的替代和插入/缺失其实包含了大量生物学信息，人们对于核酸序列检测的兴趣愈加浓厚。现在，人们普遍认为，在人类或其他进化出复杂表型的生物(如植物和牲畜物种的生产性能属于复杂表型)，这些单核苷酸替代是造成众多单基因遗传病和多基因遗传病的主要原因。因此在许多情况下，单核苷酸替代与人类、植物和动物的重要性状相关或至少提示了人类、植物和动物的重要性状。

分析这些单核苷酸替代和indels将得到丰富的有价值的信息。这些信息将对医药和农业的方方面面产生广泛的影响。举例来说，可以预期的是，这个领域的发展有可能实现个性化医疗。分析这些遗传多态性越来越需要有足够多的、可靠和快速的方法能够高通量地处理大量样品和大量SNPs(主要)，而几乎不影响得到的数据质量。其中，分析已知核酸序列的主要方法是基于两个探针与靶序列退火，两个探针结合在靶序列的相邻位置，而后连接这两个探针。

美国专利4,988,617(Landegren等人)已经描述了寡核苷酸连接检测技术的原理(OLA)。这个专利公开了在可能存在已知突变的已知核酸序列区检测核酸序列的方法。为了检测基因突变，选定寡核苷酸，退火，使之恰与待测片段结合。其中一个选定寡核苷酸在其末端有一个核苷酸与在已知核酸序列相应位置的正常或突变的核苷酸互补。当两个探针碱基配对正确并且恰好彼此相邻时，连接酶共价连接这两个探针。连接探针的存在、缺如或其数量是已知序列和/或突变存在的标示。

尼尔森等人公开了基于OLA的其他变通的技术。见于如下文章或专利：Human mutation，2002，19,410-415；Science 1994，265：2085-2088；US 5,876,924；WO 98/04745；WO 98/04746；US 6,221,603；US 5,521,065；US 5,962,223；EP 185494B1；US 6,027,889；US 4,988,617；EP 246864B1；US 6,156,178；EP 745140B1；EP 964704B1；WO 03/054511；US2003/0119004；US 2003/190646；EP 1313880；US 2003/0032016；EP912761；EP 956359；US 2003/108913；EP 1255871；EP 1194770；EP1252334；WO 96/15271；WO 97/45559；US 2003/0119004A1；US5,470,705。

特别是OLA技术上的改进已由荷兰的Keygene，Wageningen(地名)公开。在国际专利WO 2004/111271、WO2005/021794、WO2005/118847和WO03/052142中，他们描述了几种改进OLA可靠性的方法和探针设计。在这些申请中进一步公开了可以在多重水平上实现的显著改善OLA的技术。然而，上述所有公开都有缺点，那就是它们都是基于电泳或芯片的检测方法。进一步的缺点是所用探针长度范围很大，导致扩增一致性较差。