[发明专利]利用卤代醇脱卤酶从外消旋环氧化物和氰酸盐制备光学活性的5-取代的2-唑烷酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于制备高光学活性的噁唑烷酮的方法。

背景技术

Nakamura等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.1991，180，1，124-130) 描述了卤代醇氢卤裂解酶用于合成β-羟基腈的新的催化功能。

Spelberg等人(Tetrahedron Asymmetry2002，13，1083-1089)分析了来 自放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)的卤代醇脱卤酶的生物催 化潜能。

WO2005/017141公开了改良的卤代醇脱卤酶及相关的多核苷酸。

US2003/0124693A1公开了环氧化物的酶促转化。

WO01/90397公开了环氧化物与不同的亲核试剂经酶促转化为相应的 醇。

发明详述

本发明提供了一种通过将式(1)的环氧化物与氰酸盐在卤代醇脱卤酶 的存在下进行反应并且回收高光学活性的噁唑烷酮，以制备高光学活性的 式(2a)或(2b)的噁唑烷酮的方法。

其中，R1和R2相互独立地选自氢、任选取代的烷基、芳基、芳烷基、链 烯基、环烷基，条件是R1≠R2。

所用的酶是一种卤代醇脱卤酶。非常适合的卤代醇脱卤酶是具有如序 列表(SEQ ED NO：1)所示的氨基酸序列的多肽或其同源物或其功能性衍 生物。本发明中，术语“同源物”是指与和其同源的序列具有至少90％同 源性的序列，优选至少90％相同的序列。功能性衍生物是经过了较小的衍 生或修饰而总体上没有对其酶促和催化特性造成不利影响的多肽。可采用 的酶的适当的例子是来自放射形土壤杆菌(CBS750.97)、分支杆菌菌株 GP1(Poelarends等人，J.Bacteriol.1999，181，2050)或节杆菌菌株AD2 (van den Wijngaard等人，J.Bacteriol.1991，124)的卤代醇脱卤酶。

采用提取自1997年5月7日保藏于皇家荷兰生物科技研究所培养物保 藏中心(Centraal Bureau voor de Schimmelcultures)的保藏号为CBS 750.97的放射形土壤杆菌菌株AD1(HheC)的卤代醇脱卤酶的得到了特别 好的结果。在国际专利申请WO98/53081中对另一种从该微生物中得到的 酶的环氧化物水解酶活性进行了大量的描述。

需要指出的是，根据本发明所使用的酶(卤代醇脱卤酶)应区别于环氧 化物水解酶。在Archer发表于Tetrahedron1997，53，15617-15662的论文 中，对后者进行了大量的描述。两种类型的酶所共有的唯一特点就是它们 均能从放射形土壤杆菌菌株AD1中分离得到。Lutje Spelberg等发表的论 文(Tetrahedron：Asymmetry1998，9，459-466)和欧洲专利申请EP0879 890也涉及到环氧化物水解酶的应用。

通过本领域已知的方法，包括位点定向诱变以除去易变基团和改良对 映体选择性、利用基因改组定向进化、点饱和突变、结构启发的随机诱变 或易错聚合酶链反应可以改善卤代醇脱卤酶在操作条件下的活性、稳定性 和对映体选择性。这些方法是在本领域已知的(Powell等人，ACIE2001，40， 3948；Otten和Quax，Biomol.Eng.2005，22，1；Williams等人，Cell Mol. Life Sci.2004，61，3034)。正如近期通过构建增强了活性和对映体选择性的 突变体(Tang等人，Biochemistry2005，44，6609；Tang等人，Biochemistry 2003，42，14057)和改善了稳定性的突变体(Tang等人，Enz Microb Techn. 2002，30，251)所显示的，这些诱变的方法适用于改进卤代醇脱卤酶的性能。

例如在WO2005/018579A2和WO2005/017141A1中公开了改进的卤 代醇脱卤酶。引入的突变包括以Ser替代Cys。通过在SEQ ID NO:1的134 位(Thr)引起突变，尤其是置换，如以Ala替代Thr，可以产生进一步改良 的卤代醇脱卤酶。