[发明专利]利用蓝藻生产乙醇的方法和组合物

说明书

相关申请的交叉引用

[001]本专利申请要求2006年1月13日提交的第60/758,863号美国临时专利申请的优 先权，通过全文引用的方式结合到本文中完全公开。

发明背景

现有技术描述

[0002]可再生能源的发展为社会和工业界迅速接受，以满足能源增长和减少废气排放的 目标。自工业革命以来，世界经济严重依赖于矿物燃料作为能源来源。依赖这些能源导 致了数个具有挑战性的问题，如矿物燃料资源供应的减少、污染环境和相应的全球变暖 效应。一种可替代矿物的燃料是乙醇，当今世界生产的乙醇60％来源于糖料作物，33％ 来自其他作物和7％的是通过化学合成。传统的生物生产乙醇的过程需要大量的耕地和 能源投入来满足原料增长的需求。此外，传统的发酵方法释放相当数量的二氧化碳作为 发酵过程中的副产品。例如，一个40mmgy(万加仑每年)生物乙醇工厂每年可能会 释放121,000吨二氧化碳到环境中(BBI，2003年)，这种温室气体会加剧全球变暖效 应。

[0003]生物乙醇生产技术最近已攀升至可再生燃料技术前列，它提供了一种以石油为基 础的燃料的替代物，可对生产和消费过程加以调控。此外，考虑到生产和燃料工业，生 物系统来源的乙醇，尤其具有吸引力的是因为它可以非常容易地整合许多现有的基础设 施。对使用活的生物体来生产乙醇的各种方法已进行了相关研究。大部分研究集中在通 过微生物来生产乙醇。如利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和含特有乙醇遗传 因子的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。这两种微生物含产生酵素丙酮酸脱羧酶 (pdc)和乙醇脱氢酶(adh)的遗传信息，能从丙酮酸中产生乙醇，这是糖酵解途径 中的产物。Woods等人(美国专利号6306639和6699696；也见Deng和Coleman， ＂Ethanol Synthesis by Genetic Engineering in Cyanobacteria＂Applied and Environmental Microbiology(1999)65(2)：523-428)揭示了遗传修饰后的蓝藻对乙醇的产生是很有帮助 的。Woods等人报道了经过30天的培养乙醇产量是5mM的水平。

[0004]因此，寻求一种简单、有效和成本适宜的用来产生大量乙醇的生物系统是非常必 需的。

发明摘要：

[0005]上述技术存在着各种不足。如woods描述的系统存在着乙醇产量低、发酵时间长 以及不稳定的不足。

[0006]在一些实施例中，所需要的是一种简单，有效和成本合适的系统来产生大量的乙 醇。本发明涉及到了方法，组合物，宿主细胞以及为优化乙醇生产所用的载体和宿主细 胞来优化乙醇生产和达到更加经济的乙醇浓度的宿主细胞耐受力。

[0007]根据本发明实施例公开一个核酸结构。核酸序列包括：光反应启动子，编码丙酮 酸脱羧(pdc)酶的序列，以及编码乙醇脱氢(adh)酶的序列。

[0008]根据本发明实施例公开一个表达载体。表达载体包括一核酸，该核酸包括光反应 启动子、编码丙酮酸脱羧酶(pdc)的序列以及编码乙醇脱氢酶(adh)的序列的核酸 组成。

[0009]根据本发明实施例公开一个宿主细胞。宿主细胞包含一个表达载体，表达载体的 核酸组份包括光反应启动子，编码丙酮酸脱羧酶(pdc)的序列，以及编码乙醇脱氢酶 (adh)的序列。

[0010]根据本发明实施例公开一种经遗传工程修饰的蓝藻，蓝藻包含一个核酸结构，核 酸结构包含编码丙酮酸脱羧酶(pdc)以及编码乙醇脱氢酶(adh)的核酸序列，其特 征在于经5天发酵后蓝藻能够产生可回收量大于约10mM的乙醇。

[0011]根据本发明实施例公开一种生产乙醇的方法，方法包括：在培养基中培养蓝藻， 该蓝藻含一个核酸结构，其包括来源于运动发酵单胞菌pL0I295质粒的编码pdc以及 adh酶的DNA片段组成；蓝藻在培养基中经5天发酵后累积的乙醇量能够达到大于约 10mM的水平。

附图说明

[0012]图1.为质粒结构图谱(a)pPSBAIIKS和(b)用于构建pMota的pLOI295。

[0013]图2.为反应器中乙醇浓度与时间的关系，乙醇浓度经5天发酵后达到 13mM。对照组为未转化的野生型集胞藻(Synechocystis)。