[发明专利]包特氏菌减毒活菌株作为抗百日咳的单剂量疫苗

说明书

发明领域

本发明涉及包特氏菌(Bordetella)突变菌株，其至少含有突变的ptx基因、 缺失或突变的dnt基因以及异源的ampG基因。包特氏菌减毒突变菌株可以用 于产生免疫性的组合物或疫苗用于治疗或防止包特氏菌感染。本发明还涉及包 特氏菌减毒菌株用于制备疫苗或产生免疫性的组合物的应用，以及用于保护哺 乳动物免受包特氏菌感染的方法。

背景技术

百日咳(Pertussis)仍是全球死亡的主要原因，并且即使在疫苗高度覆盖 的国家，其发病率也在逐渐提高。尽管所有年龄群都是易感染的，但其在婴儿 中是最严重的，因为婴儿太年轻而不能受到目前可以利用的疫苗保护。

在20世纪后半叶引入有效疫苗之前，百日咳(whooping cough)或百日 咳(Pertussis)是引起高死亡率的严重儿童疾病。这些疫苗的成功引发关于该 疾病被基本上得到控制的观点，然而据报道每年仍有200,000～400,000例百日 咳相关的死亡，并且该疾病仍在由于传染性物质所引起死亡的病因中排第6 位[1]。尽管主要在发展中国家流行，但在包括美国的发达国家，该疾病又重 新出现了[2，3]，在过去的20年中，美国的发病率已经提高了5倍[4]。出乎 意料的，在高疫苗覆盖的国家，百日咳的流行病学已经改变，在这些国家青少 年和成年人的百日咳日益频繁[5]。这可能是因为在青少年期日益减弱的疫苗 介导的免疫。百日咳通常是非典型因此难以诊断的，并且通常在成年人中不是 威胁生命的，因此，在许多病例中百日咳仍被忽视。然而，被感染的成年人构 成了重要的储存宿主把该疾病传播到非常年轻的儿童，这些儿童太年轻而未被 接种疫苗，因此有发展成具有高死亡率的严重疾病的风险。

百日咳接种疫苗通常在2个月大时开始，而完全的保护需要以1～2个月为 间隔的至少3次免疫接种。因此，在6个月大之前，使用目前可以利用的疫苗， 婴儿不能完全被保护。为了降低非常年轻和大部分容易受到攻击的年龄组中百 日咳的发病率，早期的免疫接种，可能在出生时，将是高度期望的。然而，在 人类和动物模型中的大量研究显示，新生儿的免疫系统太不成熟，而不能有效 地诱导疫苗介导的保护性免疫[6，7]。与较大的儿童或成人相比，对于产生对 百日咳的保护性免疫很重要的Th1应答的指示[8]，特别是IFN-γ的产生，似 乎在人新生儿中显著降低[9]。这一点也通过以下事实得以反映，即，在儿童 中使用百日咳疫苗，特别是非细胞疫苗(aPV)进行接种疫苗，仅能够在几个 月(≥6个月)后产生显著量的抗原特异性IFN-γ[10]。

包特氏百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)的自然感染长期以来被认为诱导 长期的强免疫性，其衰退比疫苗诱导的免疫性要晚得多[5，11]。而且，包特 氏百日咳杆菌的感染即使在非常年轻的儿童中(1个月大)也诱导了可检测的 抗原特异性Th1型免疫应答[12]。这些观察结果暗示，可以通过经鼻途径以便 尽可能模拟自然感染来施加的活疫苗，可以是比可利用的疫苗更吸引人的替 代。

现有技术中已知有许多进行接种疫苗的组合物用于治疗包特氏菌感染。然 而，这些用于治疗的产生免疫反应的组合物没有被用于治疗新生儿，或者未用 于需要流行性的和快速保护性的免疫的病例中。

因此法国专利FR0206666公开了缺失选自PTX、DNT、AC和TCT中至 少两种毒素的包特氏菌菌株。该专利公开了通过加入强启动子，以及加入来自 大肠杆菌(E.coli)ampG基因的11个末端氨基酸，从而过表达内源性ampG 基因。

Mielcarek等人在Vaccine(2006；24S2：S2/54-S2-55)中公开了一种PTX^-， DTN^-和TCT^-包特氏百日咳杆菌减毒菌株，用于小鼠的免疫接种。该参考文献 公开了，为了降低气管细胞毒素的产生，ampG基因需要被过表达。然而，通 过进一步评测，作者认识到通过过表达ampG基因，气管细胞毒素有提高，而 不是一开始认为的降低。

Mielcarek等人在Advance Drug Delivery Review51(2001)pgs.55-69中公 开了，活疫苗在通过口服或经过经鼻途径给药时，能够诱导系统性和粘膜应答。