[发明专利]展示蛋白质A作为向脑部递送的抗体和免疫复合物的结合剂的丝状噬菌体

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及用于向脑部递送抗体和免疫复合物的丝状噬菌体展示载体及其在诊断和治疗中的用途。

相关技术描述

噬菌体展示：

组合噬菌体展示肽文库提供了研究蛋白质：蛋白质相互作用的有效方法。该技术依赖于非常大的随机肽样本的产生，所述随机肽与它们相应的遗传蓝图相关(Scott等，1990；Dower，1992；Lane等，1993；Cortese等，1994；Cortese等，1995；Cortese等，1996)。通常通过构建在丝状噬菌体，诸如M13，fd和f1的外表面上表达的嵌合蛋白实现随机肽的呈递现。该呈递使所有组成部分可以经受结合测定和专门的筛选方案(称为淘选(biopanning)(Parmley等，1988))，从而导致对具有所需结合特性的肽的亲和分离和鉴定。以这种方式，已经对与受体(Koivunen等，1995；Wrighton等，1996；Sparks等，1994；Rasqualini等，1996)、酶(Matthews等，1993；Schmitz等，1996)或抗体(Scott等，1990；Cwirla等，1990；Felici等，1991；Luzzago等，1993；Hoess等，1993；Bonnycastle等，1996)相结合的肽进行了有效的选择。

丝状噬菌体是非裂解、雄性特异性噬菌体，其感染携带F-附加体的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(综述参见Model等，1988)。丝状噬菌体颗粒以900nm长和10nm厚的细管状结构存在，其含有环形单链DNA基因组(+链)。噬菌体的生命周期需要所述噬菌体与细菌F-菌毛的结合，以及随后所述单链DNA基因组进入宿主。由宿主复制系统识别所述环形单链DNA，并且在噬菌体的复制起始点(-)结构处开始合成互补的第二条DNA链。该双链DNA复制形式是合成单链DNA环形噬菌体基因组的模板，其起始于复制起始点(+)结构处。最终将这些包装到病毒体中，并且在不引起对宿主的裂解或明显损害的条件下，将噬菌体颗粒从细菌中挤压出来。

肽展示系统已经开发了两种噬菌体的结构蛋白：pIII(P3)蛋白和pVIII蛋白。pIII蛋白以5个拷贝/噬菌体而存在，并且专门存在于病毒体的一个尖端(Goldsmith等，1977)。pIII蛋白的N-末端结构域形成结状结构，该结构对感染过程是必需的(Gray等，1981)。这使得噬菌体能够吸附到F-菌毛尖端以及随后所述单链噬菌体DNA渗透和易位到细菌宿主细胞内(Holliger等，1997)。pIII蛋白可以耐受大范围的修饰，且因此被用于在其N-末端表达肽。在不显著影响pIII蛋白功能的条件下，外源肽长达65个氨基酸残基(Bluthner等，1996；Kay等，1993)，并且在有些情况中，甚至与全长蛋白质一样大(McCafferty等，1990；McCafferty等，1992)。

围绕着单链噬菌体DNA的圆柱状蛋白包膜由2700个拷贝的主外壳蛋白、pVIII、α-螺旋状亚基组成，其中所述α-螺旋状亚基由50个氨基酸残基组成。PVIII蛋白自身以螺旋状模式排列，其蛋白的α-螺旋以锐角朝向病毒体的长轴(Marvin等，1994)。该蛋白的一级结构包含3个分离的结构域：(1)N-末端部分，富含酸性氨基酸并暴露于外界环境；(2)中央疏水结构域，其负责：(i)噬菌体颗粒中的亚基：亚基相互作用和(ii)宿主细胞中的跨膜功能；和(3)含有碱性氨基酸并聚集在C-末端的第三结构域，其包埋在噬菌体的内部并与噬菌体-DNA相缔合。pVIII合成为含有23个氨基酸的前导肽的前外壳蛋白，其在跨越细菌内膜易位时分裂，从而产生成熟的50个-残基的跨膜蛋白(Sugimoto等，1977)。pVIII作为展示支架的用途受到这样的事实的阻碍，所述事实是pVIII可以耐受在其N-末端添加不长于6个残基的肽(Greenwood等，1991；Iannolo等，1995)。更大的插入物干扰噬菌体的装配。然而，在这样的系统中引入更大的肽是可能的，所述系统中通过将含有肽、pVIII蛋白的重组体与野生型pVIII在体内混合而产生嵌合噬菌体(Felici等，1991；Greenwood等，1991；Willis等，1993)。这允许在噬菌体颗粒装配的过程中将嵌合pVIII蛋白以低密度(数十到数百个拷贝/颗粒)结合到由野生型外壳蛋白所点缀的噬菌体表面上。使用了两种能够生成嵌合噬菌体的系统：由Smith命名的“8+8型”和“88型”系统(Smith，1993)。