[发明专利]生产涎化低聚糖的方法

权利要求书

1.一种生产包含至少一个唾液酸残基的涎化低聚糖的方法，所述 方法包括以下步骤：

a)培养微生物，所述微生物包含编码CMP-Neu5Ac合成酶、唾液 酸合酶、GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸转移酶的异源基因，

其中编码唾液酸醛缩酶NanA和ManNac激酶NanK的内源基因被 灭活，所述微生物能够内部生产激活的唾液酸，以作为所述唾液酸转 移酶的供体底物，

其中所述微生物是大肠杆菌；并且其中

培养所述微生物发生在培养基中，其中所述培养基包含选自乳糖、 半乳糖、β-半乳糖苷或α-半乳糖苷的外源前体，其中所述外源前体主 动摄取入微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中异源唾液酸转移酶基因选自 编码α-2,3-唾液酸转移酶、α-2,3-和α-2,8-唾液酸转移酶cstII和α-2,6- 唾液酸转移酶的基因。

3.根据权利要求1-2中的一项所述的方法，其中编码异源 CMP-Neu5Ac合成酶的基因是neuA，编码异源唾液酸合酶的基因是 neuB，编码异源GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶的基因是neuC。

4.根据权利要求3所述的方法，其中neuA、neuB和neuC分离自 在其细胞中含有涎化结构的细菌菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其中细菌菌株为空肠弯曲菌 C.jejuni菌株ATCC登录号43438。

6.根据权利要求1所述的方法，其中nanT和nanE基因被灭活。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物进一步编码促进 乳糖主动摄取的蛋白，并缺少代谢乳糖的酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌E.coli 菌株，其为LacY+，LacZ-。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌E.coli 菌株，其为MelA-。

10.根据权利要求1所述的方法，其中该外源前体是globotriose， 所述globotriose是Galα-4Galβ-4Glc。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因被灭活是指基因被 敲除。

12.一种微生物，

所述微生物是大肠杆菌菌株，

所述微生物包含编码CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合酶、 GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸转移酶的异源基因，

其中编码唾液酸醛缩酶NanA和ManNac激酶NanK的内源基因被 灭活，

所述微生物能够内部生产激活的唾液酸，以作为所述唾液酸转移 酶的供体底物。

13.包含乳糖作为前体以及权利要求12所述的微生物的细胞培养 基。

14.根据权利要求12所述的微生物，其中所述基因被灭活是指基 因被敲除。

15.根据权利要求1所述的方法，用于生产3’涎化乳糖或6’涎化 乳糖，包含下述步骤：

以高细胞密度在选自葡萄糖或甘油的碳底物的培养基中培养所述 微生物，

并以乳糖饲养，

乳糖被所述微生物的乳糖透性酶内在化并且被所述的微生物的所 述重组唾液酸转移酶使用由UDP-GlcNAc内源生成的CMP-Neu5Ac涎 化。

16.根据权利要求1所述的方法，用于生产GD3，

其中该异源唾液酸转移酶基因是编码双功能的α-2,3和α-2,8唾液 酸转移酶的基因，其催化唾液酰基从内部产生的活化的唾液酸分子转 移到GM3以形成GD3，

所述GM3是Neu5Acα-3Galβ-4Glc，

所述GD3是Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-4Glc。