[发明专利]用于通用分子识别的植物嵌合结合多肽

说明书

发明背景

蛋白对靶的结合特异性和亲和性主要由一个或多个结合区域内蛋 白的氨基酸序列所决定。因此，改变相关区域的氨基酸序列重构了蛋 白的结合性质。

在自然界中，蛋白结合中的组合变化由免疫系统产生的免疫球蛋 白的大量排列提供了最好的说明。每个免疫球蛋白包含一组短的、事 实上独一无二的被称为超变区(即蛋白结合结构域)的氨基酸序列， 以及另一组较长的被称为恒定区的不变的序列。尽管在免疫球蛋白群 体中的超变区之间存在庞大的序列多样性，但恒定区形成了β片层， 稳定了蛋白的三维结构。每组超变区都赋予结合特异性和亲和性。两 条重链和两条轻链免疫球蛋白装配成大的蛋白复合物(即抗体)，进 一步增加了具有多样结合活性的组合数量。

抗体的结合多样性已经被成功地用于许多生物医学和工业应用。 例如，已经构建了表达带有人工多样化超变区域的免疫球蛋白的文库。 免疫球蛋白表达文库对于鉴定针对靶分子(例如受体或受体的配体) 的高亲和性抗体是非常有用的。然后可以分离所鉴定的免疫球蛋白的 编码核酸，并将其在宿主细胞或生物体中表达。

但是，尽管免疫球蛋白和抗体总体是有用的，它们在转基因植物 中的表达却可能成问题。因为需要形成多个二硫键，免疫球蛋白不能 在植物细胞质中适当地折叠。此外，免疫球蛋白的大尺寸也阻止了它 们被某些植物害虫有效摄取。因此，免疫球蛋白通常来说不像蛋白杀 虫剂或杀虫剂靶向分子那样有用。最后，在可食用植物中表达哺乳动 物蛋白例如免疫球蛋白(例如所谓的“植物抗体”)也带来了潜在的 消费者接受性的问题，因此对商业化来说是一个障碍。这可能有效地 阻止了将植物抗体用于转基因植物的许多输入和输出性状。

上面提到的免疫球蛋白的缺点可以通过产生来自其它类别的结构 耐受蛋白、优选为植物来源蛋白的结合蛋白多样性文库来克服。这些 文库可以被筛选，以鉴定可以与目的靶以所需的特异性和亲和性结合 的个体蛋白。然后，可以将鉴定的结合蛋白在转基因植物中有效地表 达。

发明简述

本文描述了编码植物嵌合结合多肽的核酸的多样性文库以及产生 它们的方法。嵌合结合多肽在概念上与免疫球蛋白类似，在于它们的 特点都是在编码结构牢靠的蛋白的不变序列构成框架中具有高度可变 的结合结构域。但是，本文描述的嵌合的结合多肽具有来源于植物蛋 白序列的显著优点，因此避免了与在植物中表达免疫球蛋白有关的许 多问题。被编码的植物嵌合结合蛋白的氨基酸序列源自包含了要变化 的子序列的支架多肽序列。该变化的子序列对应于植物嵌合结合多肽 的推定的结合结构域，在编码的植物嵌合结合蛋白的文库中是高度异 源的。相反，在变化的子序列之外的编码的嵌合结合蛋白的序列则与 亲本支架多肽序列基本上相同，并在整个编码的植物嵌合结合蛋白的 文库中是高度同源的。这样的文库可以用作通用的分子识别平台，以 筛选具有高度选择性和亲和性结合的蛋白，用于在转基因植物中表达。

因此，本文描述的一个方面是至少10种(例如至少1000、10⁵或 10⁶种)不同的嵌合结合多肽的编码核酸分子的文库。每种多肽的氨基 酸序列包括C₁-X₁-C₂-X₂-C₃-X₃-C₄，其中C₁-C₄是选自紫色酸性磷酸酶 (即分别为SEQ ID NO：1-30、31-60、61-90和91-120)的骨架子序列， 对于选定的紫色酸性磷酸酶序列，可以包含最多30个(例如20、10 或5个)单个氨基酸取代、缺失、插入或添加。C₁-C₄子序列在文库中 编码的许多多肽中是同源的。与C₁-C₄骨架子序列相反，X₁-X₃子序列 是由2-20个氨基酸构成的独立可变的子序列，这些子序列在文库的许 多多肽中是异源的。例如，嵌合多肽的文库可以含有SEQ ID NO： 124-126任何一个中的氨基酸序列，包括对应于SEQ ID NO：124-126 的23-39、51-49和79-84氨基酸位置的1个到10个单个氨基酸取代、 缺失、插入或添加。