[发明专利]从脂肪组织提取内皮细胞的方法

说明书

技术领域

[0001]本发明涉及细胞培养和纯化领域。特别地，本发明涉及内皮细胞培养和纯化。

背景技术

[0002]对于细胞治疗和组织工程中的许多应用，需要从患者组织获得内皮细胞，用于移植回同一个患者。为了使操作成本降到最小，以及使内皮细胞在培养期间任何可能发生的变化减到最小，在几小时内迅速分离大量的内皮细胞是有利的。为了使这种内皮细胞实际上有用，通常需要获得大量的细胞(如，大于1百万)，并且需要得到相当高纯度的分离细胞(如，大于90％的内皮同一性)。此外，期望将分离时间减到最少，这提高细胞存活力并且增加应用便利性。

[0003]搭桥手术(旁路手术，bypass surgery)是冠脉疾病和外周血管疾病的常用治疗方法，冠脉疾病和外周血管疾病在美国和欧洲都是死亡率的最大原因(1，2)。在2004年，进行了427,000台冠状动脉搭桥手术(2)。在搭桥手术中自体静脉移植物的开放性优于人工移植物(prosthetic graft)的开放性；然而，达30％的患者不具有用于搭桥术的合适静脉。在这些患者中，使用小直径的人工移植物，其导致相当高的失败率。人工移植物和自体静脉移植物之间开放性的巨大差异可能部分地归因于人工移植物的腔表面上缺乏防止血栓形成的内皮细胞(EC)(3，4)。因此，开发在人工血管移植物上成功接种EC的策略将最可能提高对这些移植物观测的开放性。

[0004]EC接种(EC seeding)可以以单阶段或两阶段程序进行(5)。两阶段接种涉及有限的EC在体外的扩增，其可能需要4-5周(6)，因此，它对于紧急患者护理是不合适的。此外，EC的体外扩增需要高成本的GLP设备。单阶段接种是分离大量的EC并且随后立即接种在人工移植物上。几个研究者已经尝试开发单阶段接种程序(5)。已报道脂肪组织含有丰富的、容易获得的微血管内皮细胞(MVEC)(7，8)。在动物模型中，带有脂肪来源的EC的接种的血管移植物具有增强的开放性(9-11)，然而，在人类中的临床试验结果是令人失望的(12，13)。原因可能是：人类不同于犬科动物，缺乏自我内皮化(self-endotheliazation)能力。此外，分离自脂肪组织的污染的非内皮细胞促进内膜增生(14-17)。因此，找到分离大量高纯度EC的快速且稳定的方法，对于小直径人工移植物植入的成功是至关重要的。

[0005]一般来说，两类方法已被用于纯化来自不同组织的内皮细胞。阳性选择涉及偶联有EC特异性抗体或分子如血小板内皮细胞粘附分子(PCAM/CD31)、CD34、ve-钙黏着蛋白(CD144)、或荆豆凝集素-1(Ulex europaeus agglutinin-1，UEA-1)的磁珠的应用(18-20)；阴性耗减(negtive depletion)使用抗非内皮细胞的特异性抗体排除细胞如成纤维细胞或单核细胞(21)。使用CD34 Dynabeads被阳性选择的细胞或使用抗成纤维细胞和单核细胞抗体被阴性选择的细胞分别为约87％和71％CD31阳性。然而，应用CD34珠的EC恢复只有约24％(19)。此外，通常使用粗制胶原酶分离EC，其显示实质的批次变化并且每次改变批次时需要确认(22)。

[0006]本领域一直需要更快和更成功的内皮细胞恢复和接种，例如，用于体内应用。

发明内容

[0007]本发明的第一个实施方式提供从脂肪组织制备内皮细胞的方法。洗涤得自吸脂术的脂肪组织并且从该组织收集细胞。用纯化的胶原酶制备物对细胞进行酶处理。该制备物被耗尽(depeleted)胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。在一个实施方式中，制备物包括纯化的中性蛋白酶(分散酶)。通过与包含第一抗体的磁珠接触来分选处理细胞，所述第一抗体对选自CD31、CD34、CD144和CD146的第一组的抗原或选自CD14、CD45和F19的第二组的抗原具有特异性。如果抗体对于第一组中的抗原具有特异性，则收集结合到所述磁珠的细胞，如果抗体对于第二组中的抗原具有特异性，则收集未结合到所述磁珠的细胞。

[0008]本发明的第二个实施方式是分析内皮细胞制备物对于接种在血管移植物中的适宜性的方法。内皮细胞制备物被接种在适合内皮细胞的培养基中3天或更短的时间。培养基处于具有包被了细胞外基质蛋白的表面的容器(vessel)中。确定制备物中粘附到表面的细胞的量。

[0009]本发明的另一实施方式是分离自脂肪组织的内皮细胞群。该细胞群具有下述特征：

细胞群中大于80％的细胞是存活的；