[发明专利]具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶，和用于测定肌酸酐的试剂组合物

说明书

技术领域

本发明涉及具有对底物提高的亲和性的修饰的肌酸酐酰胺水解酶(还表示为肌酸酐酰胺水解酶(creatinine amidohydrolase))，编码所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的基因，生产所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶的方法，和所述修饰的肌酸酐酰胺水解酶在肌酸酐测定试剂中的各种应用。 

背景技术

对存在于血液或尿液中的肌酸酐的快速和准确的检测和测定对于诊断疾病如尿毒症、慢性肾炎、急性肾炎、巨人症和紧张性肌肉萎缩症非常重要。 

与其它酶诸如肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶和过氧化物酶一起，肌酸酐酰胺水解酶(EC3.5.2.10)已经用作用来测定体液中的肌酸酐的酶，其是肌肉和肾脏疾病的临床诊断的指示剂。肌酸酐酰胺水解酶是作用在肌酸酐上，以在水的存在下催化从肌酸酐形成肌酸的可逆反应的酶。 

已知这样的肌酸酐酰胺水解酶由假单胞菌属(Pseudomonas)(非专利文献1)和产碱菌属(Alcaligenes)(非专利文献2)种属的微生物生产。另外，作为肌酸酐酰胺水解酶的其它生产者，仅有黄杆菌属(Flavobacterium)，棒杆菌属(Corynebacterium)，微球菌属(Micrococcus)(专利文献1)，青霉菌属(Penicillium)(专利文献2)等种属的微生物是已知的。其中，已经分离了编码由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)PS-7生产的肌酸酐酰胺水解酶的基因，并且已经公布了其氨基酸序列(专利文献3)。 

非专利文献1：Journal of Biochemistry(生物化学杂志)，第86卷，1109-1117(1979) 

非专利文献2：Chemical and Pharmaceutical Bulletin(化学和药物学公 告)，第34卷，第1期，269-274(1986) 

专利文献1：JP51-115989A 

专利文献2：JP47-43281A 

专利文献3：日本专利2527035 

然而，由各种已知的微生物生产的肌酸酐酰胺水解酶作为用于临床检测的酶针对肌酸酐具有大的Km值，并且因此，应该将更多量的该酶加入到试剂组合物中。例如，报道从粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)TE3581衍生的酶(专利文献4)针对肌酸酐具有约42mM的Km值。从节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)TE1826衍生的另一种酶针对肌酸酐具有约66mM的更大的Km值(专利文献5)。 

专利文献4：JP9-154574A 

专利文献5：JP10-215874A 

为了定量测定肌酸酐，通过用肌酸酐酰胺水解酶、肌酸脒基水解酶、和肌氨酸氧化酶处理样品中的肌酸酐，并且通过测定过氧化氢的方式测定所得到的过氧化氢而定量测定样品中的肌酸酐的方法是已知的。 

为了实施这样的方法，通常使用普遍适用的自动分析仪，其中通过将试剂分成两部分或多部分，将所述部分以预先测定的加入顺序逐一加入到反应单元中，以作为整个步骤，使所述部分反应约数分钟-约20分钟，在该期间过程中随时间监测吸光度的增加和减少，并且分析和计算结果，而测定目标物质的浓度。存在许多可以用于这些自动分析仪中的已知的试剂。 

非专利文献3：Medical Technology(医学技术)，第10卷，第7期，575-579(1982) 

然而，在常规方法中，由于花费更长的时间阶段才能使反应达到终点，所以被分析的样品数目是有限的。另一方面，为了在短时间阶段内完成反应，应该升高加入的酶的量，这引起了经济问题。 

附图简述 

图1举例说明本发明的试剂和比较例的试剂的反应性评价的结果。

●：本发明的制剂 

○：比较例的制剂 

图2举例说明本发明的试剂和比较例的试剂的反应性评价的结果。 

●：本发明的制剂 

○：比较例的制剂 

发明内容

本发明待解决的问题 

本发明的一个目的是提供一种肌酸酐酰胺水解酶，如上文所提及，其克服已知的肌酸酐酰胺水解酶的缺点并且具有针对肌酸酐的提高的亲和性，即，具有针对肌酸酐的更小的Km值。 

此外，考虑到上述情形，本发明的另一个目的是提供用于测定肌酸酐的试剂组合物，其适用于自动分析仪，并且准确性、精确性和经济效率极好。 

解决问题的方式