[发明专利]用于检测人和禽类流感病毒的核酸引物及探针

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)主张于2006年4月28日提 交的美国临时专利申请60/795,785的优先权，其内容全部整合在本文 中。

技术领域

概括地说，本发明涉及用于检测人和禽类流感病毒的诊断 检测法的核酸序列。更具体地，本发明涉及特异检测禽流感A (“INFA”)病毒亚型和人INFA及流感B(“INFB”)病毒株的引 物和探针。所述序列可用于在单重检测中检测样品中的流感病毒，或 用于在多重检测中对样品中的流感病毒以及其它呼吸道疾病相关的 流感病毒进行检测。

发明背景

共有三种类型的流感病毒：INFA、INFB和流感病毒C (“INFC”)。毒性最大的流感病毒是流感病毒A，它可以感染人、 鸟、猪、马、海豹、鲸及其它动物。以野生鸟类作为天然宿主的流感 病毒被称为禽流感病毒，而以人为天然宿主的流感病毒被称为人流感 病毒。经驯养的鸟类，例如火鸡和家鸡，可因禽流感病毒导致致命的 病害，通过与感染的驯养鸟类接触而感染了禽流感病毒的其它动物和 人类也是如此。驯养的鸟类可通过与感染的野生鸟类、其它感染的动 物的直接接触、与含病毒的表面、或污染的食物或水的接触而被禽 流感病毒感染。迄今为止，那些具有交叉种而且可感染人的禽流感病 毒是近来人流感大流行的原因。通常仅感染人的流感B和流感C病毒的 毒性小于流感A。流感B病毒是流感在局部地区流行的原因，而不是造 成世界范围内流感流行的原因。毒性最弱的流感C病毒从来没有造成 过任何世界范围内人流感的流行。

流感病毒是一种基因组含有8个单链负义RNA节段的有包 膜病毒。病毒包膜具有宿主来源的脂双层，脂双层含有两种主要的表 面病毒糖蛋白：血凝素(“HA”)和神经氨酸酶(“NA”)，它们 是负责病毒附着的蛋白。在包膜中，基质蛋白M1和核蛋白(“NP”) 保护病毒的RNA。流感病毒的A、B及C型命名是基于M1基质蛋白和 NP的抗原特性。8个RNA节段编码至少10种病毒蛋白：节段1、2和3 编码三种病毒聚合酶蛋白；节段4编码HA；节段5编码NP；节段6编码 NA；节段7编码M1和M2基质蛋白，其中前者具有离子通道活性，包 埋在病毒包膜中；片段8编码非结构蛋白NS1和NS2，其中前者阻断宿 主的抗病毒应答，而后者参与病毒颗粒的组装。

通过病毒表面的HA和NA蛋白的亚型可鉴定INFA病毒。 INFA病毒有16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型，所有这些亚型 均以多种不同组合存在于病毒表面；因此，H5N1病毒在其表面具有 HA5蛋白和NA1蛋白。所有INFA病毒的亚型均在鸟类中发现。一般在 人类中发现的INFA亚型是H1、H2和H3亚型(H2亚型通常不传播)， 以及也已知可感染人的H5、H7和H9亚型。在鸟类中发现的INFA病毒 中，H5和H7亚型是毒性最大的；H5和H7亚型的病毒株可进一步分为 低致病性禽流感(“LPAI”)或高致病性禽流感(“HPAI”)。HPAI 的特征是HAs对多种广泛存在于细胞器和器官系统中的细胞蛋白酶的 切割高度敏感；相反，LPAIs需要特定的有活性的细胞外蛋白酶、例 如限制在呼吸腔和肠内的胰蛋白酶才可进行切割。在感染HPAI H5或 H7病毒的驯养鸟类中，90％到100％的鸟类将死亡。由于LPAI H5和 H7病毒可分别进化为HPAI H5和H7病毒，因此LPAI H5和H7病毒在驯 养鸟群中的爆发也必须被严密监控。在动物和人类中传播的禽流感病 毒的亚型包括H7N7和H3N8病毒，它们可在马中导致疾病，还有H1N1、 H1N2和H3N2病毒，它们通常在人类中传播。INFB和INFC病毒未根据 亚型进行分类。

自从1997以来，以前只感染鸟类的INFA病毒开始感染人， 并具有致命后果。已在1997(H5N1，香港)、1999(H9N2，中国大 陆和中国香港)、2002(H7N2，美国维吉尼亚)、2003(H5N1， 中国大陆和中国香港；H7N7，荷兰；H9N2，香港；H7N2，美国纽约)； 2004(H5N1；泰国和越南；H7N3，加拿大)；及2005(H5N1，泰 国和越南)年报道了确切的造成人员死亡的禽流感病毒的爆发。

由于禽IFNA病毒被迁徙的鸟类携带到全世界，并且已知病 毒可通过抗原性漂移和变异及遗传漂变而快速变异，因此用于监测禽 流感病毒的方法必须具有足够的特异性来检测抗原性和遗传性多变 的流感病毒株。