[发明专利]靶核酸序列电化学检测方法

说明书

本发明涉及靶核酸序列电化学检测方法以及用于实施所述方法的检测 组件(collection)。

已知的方法借助电化学检测，已经为鉴定给定的生物样品中靶核酸序 列的存在与否提供了可能。

这些方法尤其为检测核酸中的靶序列，例如给定的病毒的部分基因型 (patrimoine génétique)的相应序列提供了可能。

根据已知的技术，一旦鉴定了该核苷酸序列，随即制备由含有所述序 列的寡核苷酸形成的探针，然后将这些探针连接到固相支持物上。探针包 含给定数目的、具有可氧化的核苷酸碱基的核苷酸。然后将给定的生物学 样品与接枝(graft)了所述探针的固相支持物相接触，使得在合适的条件下， 包含靶序列的核酸与探针杂交。随后使杂交的核酸与能够氧化探针中核苷 酸碱基的过渡金属络合物(complex)发生反应，然后通过对样品施加可变电 场，同时测量样品中传播的电流，来确定杂交的存在与否：如果生物学样 品中含有包含所述靶序列的核酸，则会发生杂交。所述电流继而依赖于所 述能够被氧化的给定碱基的数目。事实上，当进行电位扫描(potential scan) 并同时记录样品中传播的电流时，取决于探针是否与包含靶序列的核酸杂 交，以电流表示的响应会有所不同。在任何情况下，发生杂交的探针的核 苷酸碱基氧化的电流值高于与未杂交的核苷酸碱基的氧化相关的电流值。

具体地，可以参考文件US2002/106683，其中描述了一种这样的检测 方法。

然而，这样的方法实施起来相对复杂，因为需要特别制备寡核苷酸探 针以接枝到固相支持物上，此过程时间长而且费用高。

因此，这样一个问题被摆在了人们面前：提供一种不仅易于操作而且 更加经济的方法。本发明旨在解决这个问题。

为了解决该问题，根据第一方面，本发明提出了一种电化学检测靶核 酸序列的方法，所述方法是属于这样的类型，根据该类型：提供可含有至 少一种核酸分子的生物学样品，所述核酸可以含有给定的靶序列，将所述 生物学样品与氧化剂混合，所述靶序列含有可以被所述氧化剂氧化的碱基； 提供可以与所述给定的靶序列偶联的互补装置(complementary means)；向 所述样品施加电场，所述电场能够引起所述氧化剂与所述核苷酸碱基的反 应，并测量通过所述样品的电流以确定所述靶序列的存在；根据本发明， 所述互补装置包含适合于复制所述靶序列的可活化的扩增装置，所述扩增 装置包含至少这样的核苷酸，所述核苷酸属于包含所述核苷酸碱基的类型， 其中所述类型的所述核苷酸能够在复制中被消耗从而构成复制的核酸 (replicated nucleic acids)，如果当所述扩增装置被活化时电流有所降低，则 确定所述给定的靶序列的存在。

因此，本发明的一个特点在于实施一种用于扩增核酸以及同时测量电 流的方法，该电流的测定证明或不证明在所述扩增期间扩增装置的元件之 一(具体地说，游离核苷酸之一)的消耗。这样，如果靶核酸序列与可活化的 扩增装置很好地对应，则该靶序列将在扩增过程中被复制，在该复制期间 用作底物的游离核苷酸(其浓度在开始时被确定)的数目将会减少。因此，如 果游离的核苷酸数目发生有利于掺入扩增中合成之核酸的核苷酸数目的降 低，则能够与氧化剂反应的、与游离核苷酸对应的核苷酸碱基的量将可能 越来越有限，结果电子转移将减少，最终所测得的电流将会减少。不过， 在下面的详述中，我们将更详细地说明以下几点：氧化剂还可以氧化起初 存在的核酸中掺入的核苷酸的碱基，和通过复制而合成的核酸中掺入的核 苷酸的碱基，但是另一方面，由此产生的电流弱于由游离核苷酸碱基氧化 而产生的电流。

根据本发明的一个特别有利的实施方案，寻求在其上鉴定靶序列的核 酸是单链或双链的DNA或RNA分子。因此，可活化扩增装置包含适合于 杂交靶序列上游(hybridizing upstream of)的装置和实现所述序列复制的装 置。该复制所产生的核酸数目随时间呈指数增加，从而显示可氧化的核苷 酸碱基的游离核苷酸的数目也随时间呈指数降低，与此同时，能够很快地 发现到通过样品的电流的降低。