[发明专利]利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的微生物和使用微生物生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的方法。 

背景技术

羟基羧酸类中，存在作为聚合物原料或药物中间体有用、并正在探求其高效的生产方法的物质。作为其一例，可以举出乙醇酸(α-羟基乙酸)。乙醇酸已逐渐用作洗涤剂或化妆品原料，但近年作为用作气体隔离性聚合物或医疗用聚合物的聚乙醇酸原料而受到关注。作为气体隔离性材料受到关注的原因在于，聚乙醇酸层具有较高的氧气隔离性，具有作为用于包装在氧存在下易变质的食品或碳酸饮料的材料的性能。 

目前市场上销售的化学合成品的乙醇酸含有很多杂质，作为聚合物原料存在纯度方面的问题。其原因在于，上述杂质不仅阻碍乙醇酸的脱水缩合反应，而且作为杂质之一的甲氧基乙酸是怀疑具有致癌性的化合物，故不期望包含在食品或饮料的包装材料中。尽管从技术上讲可以通过精制除去杂质，但上述精制品的价格升高，作为廉价的包装材料原料并不现实。 

为了避免化学合成品的乙醇酸中呈现的上述问题，人们正在尝试通过以乙二醇作为原料的生物学方法来制造乙醇酸。专利文献1及专利文献2中，公开了通过微生物生产乙醇酸的方法，其特征在于，在含有乙二醇的培养基中培养属于毕赤氏酵母(Pichia)属、红酵母(Rhodotorula)属、掷孢酵母(Sporobolomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、球拟酵母(Torulopsis)属的酵母、属于诺卡氏菌(Nocardia)属的菌株、属于红球菌(Rhodococcus)属的菌株、 或大肠杆菌B(Escherichia coli B)株，从培养液中分离.采集乙醇酸。专利文献1及专利文献2的实施例记载的乙醇酸生产方法中，乙醇酸蓄积浓度最高的是使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的方法，经30小时的反应可以得到35.3g/L的乙醇酸。非专利文献1中指出，对于使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的乙醇酸生产，进一步改善反应条件，经120小时的反应可以得到105g/L的乙醇酸。 

专利文献3中公开了将编码乳醛还原酶(lactaldehyde reductase)的基因和编码乳醛脱氢酶(lactaldehyde dehydrogenase)的基因以质粒的形态导入微生物，由此赋予或强化该酶活性，通过使用上述微生物，将以乙二醇为代表的末端具有羟基的脂肪族多元醇作为原料，可以生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸，进而通过破坏微生物具有的编码乙醇酸氧化酶的基因使该酶活性钝化，由此提高乙醇酸的生产率。 

在利用上述现有方法生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的反应中，由于供给到反应中的菌体量多，所以存在以下问题，即，随着菌体量多而导致制造成本升高或夹杂来自菌体的杂质，进而在羟基羧酸类制造后为了废弃菌体耗费而大量劳力和成本。 

使用氧化酶由醇制造酮的方法中，利用由随反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时简称为NADH)使反应所需的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时简称为NAD)再生的下述技术。即，将用于生产目标酮的氧化反应和用于再生NAD的酮的还原反应2个反应组合的方法、或组合利用谷氨酸脱氢酶的酮戊二酸还原反应的技术等。 

上述再生NAD的技术中，具有下述缺陷，即，必须向反应体系中添加用于NAD再生的反应基质，并且由于NAD再生反应导致反应体系内蓄积副产物。 

在由醇制造酮中，作为弥补上述缺陷的NAD再生方法，可以举出利用NADH脱氢酶的方法，即，通过微生物具有的呼吸链，还原分子状氧，生成水，由此再生NAD(专利文献4)，但尚未报道利用强化了酶活性的微生物的实例。

专利文献1：特开平10-174593号公报 

专利文献2：特开平10-174594号公报 

专利文献3：国际公开第2005/106005号说明书 

专利文献4：特开2005-218349号公报 

非专利文献1：Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.65(10)，pp.2265-2270，(2001) 

发明内容

化学合成法中，在所得羟基羧酸的纯度方面并不充分，另外，采用现有的生物学方法，存在向生产反应供给的菌体量多、菌体废弃等问题。本发明所要解决的课题在于，提供一种能够以较少的菌体量高效地生产、有利于工业的羟基羧酸类的生产方法、及适用于该生产方法的微生物。