[发明专利]CYP2C9基因扩增用引物对、含有其的CYP2C9基因扩增用试剂及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于扩增CYP2C9基因的引物对，含有该引物对的CYP2C9基因扩增用试剂及其用途。

背景技术

细胞色素P450是被分类为超家族的酶类，存在多个亚家族(例如，CYP1A、CYP1B、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A等)。这其中，现已阐明编码人CYP2C亚家族的同工酶CYP2C9的基因(CYP2C9基因)的突变对CYP2C9的底物药物-苯妥英(抗癫痫剂)和华法林(抗凝血药)的处置和效果有影响。已知CYP2C9基因的多态性CYP2C9*3是氨基酸第359位(外显子7)的异亮氨酸变为亮氨酸的突变(非专利文献1)。而且，存在该CYP2C9*3的氨基酸第359位是底物药物的识别位点，由于该氨基酸改变、立体结构(β-链)变化，因此对药物代谢相关的酶的功能有影响。因此，为了预测药物所产生的副作用、确定显示更好效果的给药条件，研究CYP2C9基因的多态性CYP2C9*3十分重要。

另外，作为在基因水平解析所有疾病的原因、个体间的疾病易感性(易患疾病)、个体间的药效的差异等的方法，广泛地进行点突变、所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测。点突变的通常检测方法可以举出：(1)利用PCR(聚合酶链反应)扩增试样的目的DNA的相当于检测对象序列的区域，再对其全基因序列进行解析的直接测序法；(2)利用PCR扩增试样的目的DNA的相当于检测对象序列的区域，通过随上述检测对象序列有无目的突变而切断作用不同的限制酶，将该扩增产物切断，进行电泳从而进行分型的RFLP解析；(3)使用目的突变位于3’末端区域的引物进行PCR，通过有无扩增判断突变的ASP-PCR法等。

但是，这些方法例如必须进行由试样提取的DNA的精制、电泳、限制酶处理等，因此需要功夫和成本。另外，进行PCR后，有必要暂时开启反应容器，因此有上述扩增产物混入到之后的反应体系内、解析精度降低的顾虑。而且，由于自动化困难，因此无法解析大量的样品。另外，上述(3)的ASP-PCR法还存在特异性低的问题。

由该问题出发，近年来作为点突变的检测方法，正在实施对由目的核酸和探针形成的双链核酸的融解温度(Tm)进行分析的方法。这种方法由于通过Tm分析或上述双链的融解曲线的分析来进行，因此称作融解曲线分析。其为如下的方法。即，首先使用与含有检测目的的点突变的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目的单链DNA与上述探针的杂交体(双链DNA)。对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的变动检测随着温度上升的杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果确定Tm值，从而判断有无点突变。在杂交产物的同源性越高时Tm值越高、同源性越低时Tm值越低。因此，对于含有点突变的检测对象序列和与其互补的探针形成的杂交产物，预先求得Tm值(评价标准值)，测定检测试样的目的单链DNA和上述探针的Tm值(测定值)。上述测定值与评价标准值相同时，则可以判断为匹配、即目的DNA存在点突变，测定值低于评价标准值时，则可以判断为错配、即目的DNA不存在点突变。而且，通过该方法还可以实现基因解析自动化。

但是，对于这种利用Tm分析的检测方法而言，存在着在PCR中，必须特异且高效地扩增含有检测目的位点的区域的问题。尤其是，CYP存在许多同工酶，编码这些酶的序列又极为类似，因此就有这样的担忧，即在PCR中连CYP2C9之外的同工酶的编码基因也被扩增。而且，这种连其它同工酶的编码基因也被扩增的情形，也成为例如使分析结果的可信度降低的原因。而且，这样一来，由于分析1个样本时伴随过多劳动力，因此存在着实际上不能实现分析大量试样的问题。

非专利文献：PMID：8873220 Pharmacogenetics.1996 Aug；6(4)：341-9。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供通过基因扩增法能够特异且高效地扩增CYP2C9基因的目的区域的引物对。

为了实现上述目的，本发明的引物对，其特征在于，其为用于通过基因扩增法扩增CYP2C9基因的引物对，含有以下引物对(1)：

引物对(1)：

包括含有下述(F1)的寡核苷酸的正向引物和含有下述(R1)的寡核苷酸的反向引物的一对引物对

(F1)：与序列号1的碱基序列中的、以第52466位的腺嘌呤碱基(A)作为第1个碱基向着5’方向直至第14～18个碱基的区域序列相同的至少一段寡核苷酸，该寡核苷酸以上述腺嘌呤碱基(A)作为3’末端