[发明专利]原代细胞繁殖

说明书

发明背景

转移是诊断具有原发性肿瘤的患者中的死亡主因。当细胞由原发性 肿瘤脱落且通过外周血流或淋巴引流散布至身体的遥远部分时，癌症转 移发生。外周血中的CTCs的存在已显示与对于转移性乳腺癌治疗的患 者中减少的无进展存活和减少的总体存活相关。尽管机械力或个体的免 疫应答杀死进入血流的这些肿瘤细胞中的许多，但已知一定百分比的肿 瘤细胞存活且可以进行分析。全血中这些稀少的上皮细胞的存在、计数 和表征可以提供有价值的诊断和临床信息。约70-80％的所有实体瘤源 于上皮细胞，这通常在循环中未发现。外周血中循环上皮细胞的mRNA 的全面分析可以提供关于肿瘤负荷预后和治疗功效的有价值的信息。例 如Her-2受体在仅30％的乳腺癌患者中超表达，这暗示赫赛汀 (Herceptin)将是关于所有患者的无效疗法。因此，CTCs的分子概况 分析应导致CTCs改善的表征且最终发展更有效的、个人化的新治疗策 略。

癌症及其转移状态的早期检测对于癌症的有效治疗是关键的，导致 总体存活率和改善的生活质量。转移起因于由初生组织脱落的肿瘤细胞 通过外周血传播到达不同组织，通常称为循环肿瘤细胞(CTCs)。如通 过CellSearch^TM技术检测的这些CTCs在血液中的存在已显示与减少的 存活率相关，因此充当关于癌症进展(转移)可预测的“标记”。这些 CTCs潜在地可以用于药物基因组学(pharmacogenomic)研究(例如， 化学敏感性)。此外，分子概况分析研究可以在CTCs上进行，这将进 一步引导我们更好地理解转移潜能/进展、预后和甚至治疗效用的潜在机 制。挑战是几重的：来自CTCs的质量核酸的回收；其以非常有限量的 可用性；现有测定的敏感性限制；用于CTCs的现有标记组的应用/验证。 此外，由于捕获的CTCs被白细胞污染，分子概况分析可能并非总是导 致精确结果，所述白细胞的表达概况可能干扰结果。使CTCs适应体外 生长可以导致细胞繁殖至足够水平且减轻前述挑战。因此繁殖的细胞可 以用于各种应用，包括评估不同细胞群体的克隆形成能力、标签的发现、 使用此种标签开发测定、荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学(IHC)。

癌症及其转移状态的早期检测对于癌症的有效治疗是关键的，导致 显著增加的存活率和改善的生活质量。转移起因于由初生组织脱落的肿 瘤细胞通过外周血传播到达不同组织，通常称为循环肿瘤细胞(CTCs)。 如通过CellSearch^TM技术检测的这些CTCs在血液中的存在已显示与减 少的存活率相关，因此充当关于癌症进展(转移)可预测的“标记”。 这些CTCs潜在地可以用于药物基因组学研究(例如，化学敏感性)。

癌症中的基因表达可以通过遗传改变或外遗传改变被破坏，这改变 基因表达的可遗传状态。人基因组的主要外遗传修饰是CpG二核苷酸的 背景内的胞嘧啶残基的甲基化。DNA甲基化从诊断观点看来是有意思 的，因为它可以在由致瘤性和癌变前病灶释放到血清、尿或痰内的细胞 中容易地检测。并且从治疗观点来看，因为外遗传沉默的基因可以通过 DNA甲基化和/或组蛋白脱乙酰酶的抑制剂进行再活化。

近来，涉及CTCs的分子表征的研究已公开，其利用经由分析和定量逆转录-PCR的表达概况分析。在这个研究中使用的样品具 有>100个CTCs，这比在早期筛选中一般可见的(<10个CTCs)高得多。 我们继续使用Quantitative Multiplex Methylation Specific PCR(QMSP) 技术以进行预扩增(嵌套式PCR)，以由捕获的CTCs(<5细胞)的小 量DNA获得足够的靶DNA。

发明概述