[发明专利]扩增DNA片段

说明书

发明领域

本发明涉及区分在邻近3’末端处具有特定序列的核酸分子与在分子内 嵌入相同序列或不含该序列的核酸分子。本发明还涉及区分在邻近3’末端 处具有不同序列的核酸分子。本发明具体涉及在共有相同靶序列的未裂解 DNA的存在下选择性扩增裂解DNA的方法。

发明背景

聚合酶链反应(PCR)基于双链DNA变性、接着寡核苷酸引物与DNA模 板退火并通过DNA聚合酶进行引物延伸这三个步骤的重复循环(参见例如 Mullis etal美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR所用寡核苷 酸引物被设计成与DNA的互补链退火，且所处的位置能使一个引物经DNA 聚合酶-催化的延伸产物可用作另一个引物的模板链。PCR扩增法导致分离 的DNA呈现出指数增加，所述DNA的长度受寡核苷酸引物的5’末端限制。

在其标准应用中，选定的引物与靶基因组内的序列匹配，并侧翼于待 扩增的DNA区域。此外，大量的PCR变异形式已被描述，其中接头与DNA 片段的末端相连接，然后接头中的序列被用于引发DNA扩增。连接-介导 PCR先被用于DNA足迹法和测序反应，其中通过DNaseI消化或化学裂解 (Mueller and Wold，1989and Pfeifer et al.1989)产生DNA末端，并延伸至通 过限制性消化形成的末端(Steigerwald et al.1990)。通过联合使用针对特定靶 区域的引物与靶向添加的接头的引物即可获得特异性。技术的变异形式具 有下述的一系列用途：基因组测序和DNA甲基化分析、染色体步查、鉴定 染色体整合或重组位点、研究突变断裂点和mRNA末端。连接-介导PCR 也可用于完整基因组的扩增，其中扩增的是具有连接末端的整个分子群体 (Schumaker et al.，2006)。

尽管连接-介导PCR具有广泛的用途，但目前仍需要改良的基于PCR 的方法学，所述方法学能选择性扩增具有3’末端的DNA，并具有简单方便、 特异性强的优点。

发明简述

本发明提供了区分在邻近3’末端处具有特定序列的核酸分子与在分子 内嵌入相同靶序列或不含该序列的核酸分子的方法。3’末端可以源自例如限 制性酶裂解或其它特异性的酶解或化学裂解，或者，3’末端也可以是PCR 产生的扩增子的游离末端，以及诸如染色体、病毒或噬菌体之类的天然DNA 的游离末端，或者，3’末端也可以由RNA模板逆转录而产生，或通过任何 其它能产生具有3’末端的核酸的方法而产生。

根据本发明的一个实施方案，本文也将其称为“末端-特异性PCR”或 ES-PCR，位于核酸分子3’末端邻近处的核苷酸序列被用于引发扩增反应， 所述反应仅当这些序列邻近于3’末端时才会发生，而当这些序列嵌入核酸 分子内部时则不会发生。

为了达到区分的目的，所使用的寡核苷酸(下文的“模板寡核苷酸”) 应具有与靶序列互补的3’部分，以及当寡核苷酸与核酸退火时能形成5’尾 的5’部分。当模板寡核苷酸与位于3’末端邻近处的靶序列退火时，在适当 的聚合酶存在下，通过游离3’末端的延伸可以复制5’尾。当模板寡核苷酸 与嵌入核酸分子内的靶序列退火时，由于缺乏游离的3’末端，不会发生5’ 尾的复制。由于其5’尾被用作位于3’末端邻近处的靶序列3’延伸的模板， 因此本文将目前所述的寡核苷酸称为模板寡核苷酸。

当靶序列邻近于3’末端时，5’尾的复制导致靶向的核酸分子的3’末端 添加了新序列，它可用于在3’末端邻近处具有靶序列的核酸分子随后的选 择性扩增。

例如，当3’末端是限制性酶裂解产物时，将会发生越过未裂解的DNA 而仅选择性地扩增裂解的DNA。

在一个实施方案中，模板寡核苷酸掺入了使寡核苷酸的3’延伸延迟的 修饰，与此同时，其5’尾通过靶序列延伸而进行的复制无阻碍地继续进行。 因此，可以选择模板寡核苷酸3’区域的核酸序列，以使在所用条件下，与 靶序列的杂交不稳定，进而，在5’尾不复制的情况下，模板寡核苷酸与嵌 入核酸分子内的靶序列的杂交受到抑制。同模板寡核苷酸与嵌入核酸分子 内的靶序列的退火(5’尾不会复制)相比，5’尾的复制增强了模板寡核苷酸与 邻近于3’末端的靶序列的退火。