[发明专利]凝固酶原以及使用所述酶检测内毒素或(1→3)-β-D-葡聚糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及编码鲎来源的凝固酶原的核酸，含有所述核酸的病毒、携带所述病毒的细胞及使用所述细胞的制备凝固酶原的方法，还涉及使用由此获得的凝固酶原检测Et或BG的方法和检测试剂盒。

背景技术

已知有使用鲎的变形细胞溶解物(鲎血球提取液，以下仅称为“溶解物”)测定Et或BG的方法。所述方法基于溶解物由Et或BG而凝固。所述凝固反应是因若干凝固因子被逐级活化而引起的(专利文献1、非专利文献1)。

例如，BG与溶解物接触，则将存在于溶解物中的G因子活化为活性G因子。所述活性G因子又将存在于溶解物中的Pro-CE活化为CE。所述CE限制性水解存在于溶解物中的凝固蛋白原分子的特定位点，由此生成凝固蛋白凝胶，从而凝固溶解物。CE也作用于合成底物(例如、叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-pNA(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA))，水解其酰胺键，从而释放pNA。因此，可通过测定生成的显色物质(pNA)的吸光度来定量BG(专利文献1)。

Pro-CE已被克隆(非专利文献2)，但是难以使用所述核酸表达保持活性的蛋白质(Pro-CE)。

也就是说，Pro-CE已经被克隆，但是本文献公开的技术方案仅是用于获得编码目的蛋白的cDNA的靶克隆的标准方法。即仅仅是使用抗CE抗体从λ gtll cDNA文库(150万个克隆)中筛选出23个克隆，亚克隆到pUC118/119载体中后，测定碱基序列。事实上，仅是这些操作，其所需工作量也非常大，因此没有进行丝氨酸蛋白酶前体proCE的酶活性(CE的蛋白酶(酰胺酶)活性)的表现和由活性B因子的ProCE的活化，或在活性C因子和B因子的共存下的酶活性的定量再现实验(重构)。测定特定蛋白质碱基序列的工作和获得所述蛋白质的重组体，并用其构建特定的测试系统的工作是需要全新水平的高技术创造性的课题。

专利文献1：特开平08-122334号公报

专利文献2：特开2006-271384号公报

非专利文献1：J.Protein Chem.，5，p255-268(1986)

非专利文献2：J.Biol.Chem.，265(36).P22426-22433(1990)

发明内容

发明拟解决的问题

本发明旨在提供可稳定、廉价、大量制备具有一定品质的Et或BG的测定试剂的编码鲎来源的Pro-CE的核酸，含有所述核酸的病毒，携带所述病毒的细胞和使用所述细胞制备Pro-CE的方法，通过使用所述制备方法获得的使用Pro-CE检测Et或BG的方法和检测试剂盒。

用于解决问题的方法

发明人在为解决上述问题而进行研究的过程中发现，通过使用携带含有编码Pro-CE的DNA的病毒的细胞，可制备具有Pro-CE活性的蛋白质，并发现可由此稳定、廉价、大量制备具有一定品质的Et和BG的检测试剂，从而完成本发明。

包括上述背景技术部分在内，本申请文件通篇使用的缩写如下。

Pro-CE：凝固酶原(pro-clotting enzyme)

CE：凝固酶(clotting enzyme)

AcNPV：苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒

BG：(1→3)-β-D-葡聚糖

Et：内毒素(也称为“脂多糖”)

HEPES：2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)

HRP：辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)

MOI：感染复数(multiplicity of infection)

NPV：核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus)

PBS：磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)

PCR：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

pNA：对硝基苯胺

PVDF：聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride)

SDS：十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

LAL：鲎变形细胞溶解物