[发明专利]在快速冷却小型生物学样品中提高冷却速度的系统和方法

说明书

相关申请的交叉引用

根据美国联邦法典35编第119(e)条(35 U.S.C.119(e))，本申请要求2006年3月30日提交的美国申请号60/787,206和2006年9月28日提交的60/60/847,666的优先权，二者通过引用纳入本文。

发明背景

1.发明领域

总体上，本发明涉及将小型(10微升或更小)生物学样品快速冷却至低温(约150K或更低)的方法和装置。这些方法和装置能最大程度减小在冷却至低温的液体和固体(例如，铜)表面之上形成的冷气层厚度，从而能在相同或相似的压力下用另一种温度更高且更均匀的气体替代该冷气层。

2.背景技术描述

冷冻保存蛋白质、细胞、组织和其它生物学样品在现代生物学和医学中起着至关重要的作用。例如，常将从天然来源提取或从遗传工程改造的生物获得并溶解于水性(含水的)缓冲液中的蛋白质冷冻在沸点或蒸发温度T_v＝77K的液氮中，然后储存在液氮、干冰(T_v＝195K)或低温冰箱中(T≈195K)，以防它们降解。然而，冻融循环常导致会影响蛋白质功能的蛋白质结构改变，以及蛋白质凝聚和沉淀。

冷冻保存精子对于动物通过人工授精繁殖、治疗人类不育症和保护濒危物种至关重要。目前的方法通常包括首先在干冰(T_v＝195K)上缓慢冷却，然后在液氮中快速冷却至T＝77K。冷冻保存和融化后的精子存活率，特别是受精率极为不同，而且往往极端不佳。

冷冻保存对于测定蛋白质分子结构的蛋白质晶体学也至关重要。用于测定蛋白质和病毒结构的X-射线易于破坏它们的晶体。将这些晶体冷却至T＝120K或更低能大大降低这种破坏作用。这样就限制了X-射线吸收产生的羟基、氢基团和其它反应物质的扩散，从而降低它们攻击蛋白质的能力。因为这些晶体含有大量水，冷冻水产生刚性框架，从而限制分子响应于破坏作用而运动。目前冷冻保护所采用的方法包括将晶体浸在冷冻保护剂中，然后将晶体插入冷气流或将其投入液氮或丙烷来冷却。这些方法破坏了晶体、降低了对它们进行X-射线衍射检测可获得的分子结构的精确性和细节。

在冷冻保存中用于除去样品的热量并将它们维持于低温的普通冷却剂包括：干冰(T_v＝195K)；封闭循环低温冰箱(T≈195K)；T约100K(氮气)或T约20K(氦气)的冷气流；处于沸点的液氮(Tv＝77K)；温度恰高于融点的烃类，例如丙烷和乙烷(分别是T_m＝90K和83K)；和T＝200K以下维持液态的低温致冷剂(含氯氟烃(CFC)和它们的现代替代品)。与气体相比，液体常能提供更有效的传热和冷却作用。在汽化之前，融解温度和沸腾温度之间差别较大(例如丙烷(T_v＝184K，ΔT＝94K)和乙烷(T_v＝231K，ΔT＝148K)并维持于恰在融解温度之上的液体能比例如氮气(T_m＝63K，ΔT＝14K)从样品中吸收更多热量。当将温暖样品投入液体中时，围绕其而产生的蒸气使得该样品与液体隔绝，从而降低了冷却速度；诸如丙烷和乙烷等液体能减少所产生的蒸气量，通常能获得较大的传热速率。对于液体样品，可通过在冷金属表面冷冻来消除气体产生的问题，但在金属表面冷却效率较低和/或破坏蛋白质晶体、细胞和组织。

蛋白质溶液、蛋白质晶体、细胞和组织均含有大量水，因此，最终的样品温度和冷却至该温度的速度对于测定冷冻样品的特性和冷冻保存的成功至关重要。如果缓慢冷却水，其形成晶体(通常是六角形的)冰。冰晶体随着水冷冻的生长可刺穿细胞壁，使蛋白质晶体晶格断裂并对生物学样品造成其它损伤。如果将水快速冷却至其玻璃化转变温度(T_g≈136K)下，可避免晶体冰形成，水会形成无定形、玻璃化或玻璃态的状态。