[发明专利]在犬细胞中表达负义病毒RNA的方法和组合物

权利要求书

1.一种如SEQ ID NO:26所示的犬RNA聚合酶I启动子。

2.一种分离核酸，所述分离核酸由权利要求1所述的启动子、编码负 链病毒基因组RNA或相应cRNA的cDNA和可选地一种或多种表达控制元 件组成，其中所述启动子操作性连接所述编码负链病毒基因组RNA或相应 cRNA的cDNA。

3.如权利要求2所述的分离核酸，其特征在于，所述一种或多种表达 控制元件选自增强子序列和转录终止序列。

4.如权利要求2或3所述的分离核酸，其特征在于，所述负链病毒基 因组RNA是流感病毒基因组RNA。

5.一种产生流感病毒基因组RNA的方法，该方法包括在细胞中转录 如权利要求4所述的分离核酸，从而产生流感病毒基因组RNA。

6.一种包含如权利要求4所述的分离核酸的表达载体。

7.一种产生流感病毒基因组RNA的方法，该方法包括将如权利要求6 所述表达载体引入细胞从而产生流感病毒基因组RNA。

8.一种包含如权利要求6所述表达载体的细胞。

9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞是犬细胞。

10.如权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述犬细胞是肾细胞。

11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述肾细胞是MDCK 细胞。

12.一种产生重组流感病毒的方法，该方法包括培养包含如权利要求6 所述表达载体和表达mRNA的一种或多种表达载体的犬细胞，其中所述 mRNA编码选自下组的一种或多种流感病毒多肽：PB2、PB1、PA、HA、 NP、NA、M1、M2、NS1和NS2，其中每一种流感病毒多肽都被用到；和 分离所述重组流感病毒。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，产生的流感病毒颗粒有 感染性。

14.SEQ ID NO:29所示的表达载体pAD4000。

15.一种产生重组流感病毒的方法，该方法包括：

(a)将表达载体引入犬细胞群，所述表达载体能在所述细胞内表达基因 组vRNA区段以提供所述病毒的完整基因组vRNA区段，其中所述表达载 体包含如SEQ ID NO:26所示的犬RNA聚合酶I启动子；

(b)将能够表达编码所述病毒的一种或多种多肽的mRNA的表达载体 引入所述细胞，其中每一种流感病毒多肽都被用到；和

(c)培养所述细胞从而产生流感病毒颗粒。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，培养所述细胞48-72小 时后产生的流感病毒颗粒滴度是至少1.0×10⁴PFU/ml。

17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，培养所述细胞48-72小 时后产生的流感病毒颗粒滴度是至少1.0×10⁵PFU/ml。

18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，产生的流感病毒颗粒有 感染性。

19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法利用辅助病毒。

20.一种产生重组流感病毒的方法，该方法包括：

i)将表达载体引入犬细胞群，所述表达载体

a)能在所述细胞中表达基因组vRNA区段以提供所述病毒的完整基 因组vRNA区段，其中一个或多个所述表达载体包含如SEQ ID NO:26所示 的犬RNA聚合酶I启动子；和

b)还能在所述细胞中表达编码选自下组的一种或多种流感病毒多肽 的mRNA：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2，其中 每一种流感病毒多肽都被用到；和

ii)培养所述细胞从而产生流感病毒颗粒。