[发明专利]生产辛伐他汀的方法

说明书

发明领域

本发明涉及在宿主细胞中对HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀(simvastatin)的发酵生产。

发明背景

胆固醇和其它脂类通过低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)在体液中运输。能实现降低LDL-胆固醇的机制的物质可用作为有效的抗高胆固醇血试剂，因为LDL水平与冠心病的风险正相关。斯汀类的降胆固醇试剂是医药上非常重要的药品，因为它们能通过抑制HMG-CoA还原酶降低血中的胆固醇浓度。后一种酶催化胆固醇生物合成中的速率限制步骤，即，(3S)-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)向甲羟戊酸的转化。如今，在降低胆固醇的应用中，辛伐他汀属于处方最常见的药物。辛伐他汀的合成并不直接，因为其涉及从天然产物洛伐他汀(lovastatin)(通过Aspergillus terreus合成)开始的半合成手段。

洛伐他汀和辛伐他汀之间的分子区别在于C-8位上的侧链。其中，洛伐他汀携带2-甲基丁酸酯基元(moiety)，而辛伐他汀则在该位置具有2，2-二甲基丁酸酯基元。从1984年发现辛伐他汀以来，世界范围内已经报道了对辛伐他汀的多种化学合成方法。US 4,444,784所述的一种途径涉及对洛伐他汀的2-甲基丁酸酯侧链的去酯化接着是数个不同的化学步骤，所述步骤涉及内酯化、羟基保护/去保护和用合适的2，2-二甲基丁酸盐/酯进行再酯化。该工艺的总产率很低。US 4,582,915描述的另一种方法涉及使用金属烷基酰胺和甲基卤化物对洛伐他汀侧链直接甲基化。该方法会遇到与终产物浓度相关的问题，因为其会导致产生若干种副产物，必须将这些副产物与目标化合物分开。此外，使用的化学物质是有毒的和/或致癌的，这使得工业规模的实施困难且有害。类似地，US 4,820,850中描述的另一种方法虽然解决了低产率和纯度的问题，但是其涉及了多达6个化学步骤，其中也利用了对于以工业规模的操作来说并不安全的试剂。US 5,763,646中描述的方法涉及使用较少的化学步骤将洛伐他汀转化为辛伐他汀。但是，该方法使用了非常昂贵的化学试剂并且总产率也很低。

作为已有化学途径的替代，WO 03/010324描述了对参与洛伐他汀生物合成的两种聚酮合酶(LovF)之一的代谢工程改造。但是，在宿主中直接发酵生产辛伐他汀的潜在问题是非天然侧链——2，2-二甲基丁酸酯的引入。通过交换LovF聚酮合酶的模块与来自其它来源的模块不能解决该问题，因为，为了合成2，2-二甲基丁酸酯侧链，经修饰的LovF酶需要在洛伐他汀生产生物(例如Aspergillus terreus)中并不存在的底物(甲基丙二酰-CoA)。在WO 00/037629中提出，可以修饰lovB基因，以生产其它的HMG-CoA还原酶抑制剂。因为lovB基因参与对莫那可林(monacolin)J核心的生物合成，事实上其它的HMG-CoA还原酶抑制剂可通过对该基因的修饰获得，但是，并不能获得辛伐他汀，因为C-8位上的侧链形成并不归lovB基因负责。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于辛伐他汀合成的发酵工艺，由此避免转化洛伐他汀所需的复杂的合成步骤，以及克服与WO 03/010324相关的问题。

本发明解决了上文列出的问题，这是通过提供下述宿主来实现的，所述宿主具有用于体内合成辛伐他汀上的2，2-二甲基丁酸酯侧链的必要构造单元(building block)。如所显示的，只要甲基丙二酸盐/酯、甲基丙二酰-CoA或2，2-二甲基丁酸盐/酯被提供给宿主细胞，具有由一种或多种洛伐他汀生物合成基因构成的基因簇的任何物种都可生产辛伐他汀。除了2，2-二甲基丁酸盐/酯自身之外，也可使用它的衍生物，例如硫酯。这可以通过外界进料来实现，或者备选地，可通过用甲基丙二酰-CoA合成途径对宿主细胞进行工程改造来实现。其它的构造单元，莫那可林J，由含有一种或多种洛伐他汀生物合成基因的该细胞生产或被供应给该细胞。因此，本发明的上述目的和任何目的可通过本发明的方法来实现，其中，所述方法包括：

●提供能将2，2-二甲基丁酸酯侧链并入辛伐他汀的宿主，即，通过定制针对2，2-二甲基丁酸盐/酯的合成和/或并入优化过的聚酮合酶来实现；

●发酵所述宿主，以获得辛伐他汀或其类似物或衍生物，即，通过以工业规模由补料分批工艺生产辛伐他汀来实现。