[发明专利]经修饰的β-内酰胺酶及其制备方法

权利要求书

1.具有如下通式的经修饰金属β-内酰胺酶蛋白：

NH₂-K-T-E-ABL-COOH

其中

K代表赖氨酸

T代表苏氨酸

E代表谷氨酸，以及

ΔBL代表已在氨基末端被截短的金属β-内酰胺酶蛋白，从而保留了所述蛋白质预测二级结构中第一α-螺旋之前的四个β-链。

2.包含编码权利要求1所述的金属β-内酰胺酶蛋白之核苷酸序列的经分离核苷酸分子。

3.权利要求2所述的核苷酸分子，其包含SEQ ID NO：2的94-756位连续核苷酸。

4.含有权利要求2所述的核苷酸分子的表达载体。

5.能够表达由权利要求2所述的核苷酸分子所编码的金属β-内酰胺酶蛋白的宿主细胞。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其分泌所述金属β-内酰胺酶蛋白。

7.权利要求5或6所述的宿主细胞，其为芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)，特别是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。

8.具有如下通式的经修饰金属β-内酰胺酶蛋白：

NH₂-E-ΔBL-COOH

其中

E代表谷氨酸，以及

ΔBL代表已在氨基末端被截短的金属β-内酰胺酶蛋白，从而保留了所述蛋白质预测二级结构中第一α-螺旋之前的四个β-链。

9.权利要求8所述的金属β-内酰胺酶蛋白，其属于金属β-内酰胺酶的B1亚组。

10.权利要求9所述的金属β-内酰胺酶蛋白，其中经截短的β-内酰胺酶来源于芽孢杆菌属，特别是来源于蜡状芽孢杆菌(B.cereus)。

11.权利要求10所述的金属β-内酰胺酶，其中E-ΔBL源自缺失成熟金属β-内酰胺酶的前11个氨基末端氨基酸。

12.权利要求9所述的金属β-内酰胺酶蛋白，其中E-ΔBL序列与SEQ ID NO：3的6-221位连续氨基酸残基所示氨基酸序列具有至少80％的同一性。

13.权利要求9所述的金属β-内酰胺酶蛋白，其中E-ΔBL序列是具有SEQ ID NO：1所示序列的金属β-内酰胺酶的截短形式，或β-内酰胺酶活性变体或其片段。

14.权利要求9所述的金属β-内酰胺酶蛋白，其中E-ΔBL源自在氨基酸KN和E之间截短金属β-内酰胺酶。

15.一种制备经修饰金属β-内酰胺酶蛋白的方法，该方法包括在使具有如下通式的金属β-内酰胺酶能够表达的条件下培养权利要求5的宿主细胞：

NH₂-K-T-E-ABL-COOH，

其中

K代表赖氨酸

T代表苏氨酸

E代表谷氨酸，以及

ΔBL代表已在氨基末端被截短的金属β-内酰胺酶蛋白，从而保留了所述蛋白质预测二级结构中第一α-螺旋之前的四个β-链，

并进行翻译后修饰，以得到具有如下通式的金属β-内酰胺酶：

NH₂-E-ΔBL-COOH，

其中E和ΔBL如上定义，以及

任选地，分离和纯化所获得的翻译后修饰蛋白质。

16.权利要求15所述的方法，其中所述金属β-内酰胺酶蛋白表达为包含信号序列的形式，由此该蛋白质可从宿主细胞分泌出来。

17.权利要求15或16所述的方法，其中所述蛋白质在芽孢杆菌属物种、特别是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌中产生。

18.包含权利要求8的经修饰金属β-内酰胺酶的药物组合物。

19.权利要求8所述的经修饰金属β-内酰胺酶用作药物。

20.权利要求8所述的经修饰金属β-内酰胺酶用于制备消除β-内酰胺类抗生素在肠道中引起不良反应之药剂的用途。