[发明专利]植物转化用粘粒载体及其应用

权利要求书

1.一种粘粒载体，其全长在15kb以内，并且具有下述的特征：

含有1)IncP质粒的复制起点(oriV)，并且不含有其它种质粒的复制起 点；

含有2)IncP质粒的trfA1基因；

含有3)IncP质粒的接合转移起点(oriT)；

含有4)IncP质粒的incC1基因；

含有5)λ噬菌体的cos位点，且该cos位点位于T-DNA的外侧；

含有6)在大肠杆菌以及农杆菌属细菌中表达的抗药性基因；

含有7)农杆菌属细菌的T-DNA的右边界序列；

含有8)农杆菌属细菌的T-DNA的左边界序列；

含有9)植物转化用选择标记基因，该基因配置在7)与8)之间，并且在 植物中表达；而且，

含有10)用于克隆外源基因的限制性酶识别位点，该位点配置在7)与 8)之间，

所述粘粒载体选自以下的组：

由序列编号2的碱基序列构成的粘粒载体pLC40；

由序列编号3的碱基序列构成的粘粒载体pLC40GWH；

由序列编号4的碱基序列构成的粘粒载体pLC40bar；

由序列编号5的碱基序列构成的粘粒载体pLC40GWB；

由序列编号65的碱基序列构成的粘粒载体pLC40GWHKorB；

由序列编号66的碱基序列构成的粘粒载体pLCleo；以及

由序列编号7的碱基序列构成的粘粒载体pLC40GWHvG1。

2.一种植物转化方法，其包括使用农杆菌属细菌转化植物，所述农杆 菌属细菌含有在权利要求1所述的粘粒载体中导入植物的核酸片段而成的 表达载体。

3.根据权利要求2所述的转化方法，其中所导入的核酸片段的大小为 25～40kb。

4.根据权利要求2或3所述的转化方法，其中，在植物的转化中使用 含有以下要素的农杆菌属细菌：

1)在将植物的核酸片段导入权利要求1所述的粘粒载体中而成的载体 中、进一步导入农杆菌属细菌的virG基因而成的载体，

以及，

2)农杆菌属细菌的Ti质粒或者Ri质粒。

5.根据权利要求4所述的转化方法，其中1)的农杆菌属细菌的virG基 因是virGN54D。

6.一种定位克隆方法，该方法包括下述工序：

1)用限制性酶将含有与植物的表型相关的候选基因的BAC克隆部分 分解或完全分解；

2)使用权利要求1所述的粘粒载体，将工序1)所得DNA片段亚克隆 化，从而构建文库；然后，

3)将构成文库的克隆分别导入植物，评价转化植物的表型。

7.根据权利要求6所述的定位克隆方法，其中，工序1)所得DNA片段 的大小为25～40kb。

8.一种植物转化方法，其包括使用下述农杆菌属细菌转化植物，所述 农杆菌属细菌包含权利要求1所述的粘粒载体，且包含下述质粒载体，所 述质粒载体

1)含有IncW质粒的复制起点，并且不含有其它种质粒的复制起点；

2)含有IncW质粒复制所必要的repA基因；

3)含有在大肠杆菌以及农杆菌属细菌中表达的抗药性基因；而且，

4)含有农杆菌属细菌的virG基因，

且选自以下的组：

由序列编号8所记载的碱基序列构成的质粒载体pVGW；以及，

由序列编号67所记载的碱基序列构成的质粒载体pVGW2。

9.根据权利要求8所述的植物转化方法，其中，具有特征1)-4)的质粒 还含有农杆菌属细菌的virB基因。