[发明专利]含有捕获探针的用于实时PCR的并可以通过杂交检测PCR产物而不需要打开PCR管的反应室

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及用于对固定化捕获分子进行核苷酸序列的聚合酶链反 应(PCR)及其检测的封闭装置。更特别地，该装置用于实时监控该序 列的扩增。本发明通过在一步测定中进行扩增和检测可以鉴定和定量 特定的基因或生物体。

2.相关技术的描述

使用核苷酸序列的分子扩增接着检测可最好地进行生物体或其一 部分如基因的检测和定量。通过几种最常见的方法来进行给定序列的 扩增，这些方法如聚合酶链反应(PCR)(美国专利4,683,195和 4,683,202)，连接酶链反应(LCR)(Wu和Wallace，Genomics，Vol. 4，p.560，1989)或循环探针反应(CPR)(美国专利5,011,769)。

PCR是最常用的扩增方法。PCR使用两个寡核苷酸引物，用于聚合 的试剂，靶核酸模板。核酸变性、退火和引物延伸的连续循环产生了 大量特定核酸片段的拷贝。使用最佳化条件时，可以将基因组DNA的 片段扩增高达10百万倍，并具有非常高的特异性和保真度。

通常在单个管中或在作为96孔或384孔平板形式的一部分的孔中 进行PCR，并且此后分析称为扩增子的扩增序列的存在。

检测PCR产物的方法描述于美国专利4,683,195中。这些方法需 要能够与扩增的靶核酸杂交的寡核苷酸探针。这些方法需要分开的扩 增、捕获和检测步骤，并且通常需要几个小时来完成。

由于PCR过程的大型扩增，来自含有高DNA含量的样品，或来自 之前扩增的小量的DNA遗留物可以产生非特异性的扩增子，甚至在不 存在有目的地添加的模板DNA的情况下。因为随着样品制备、处理和 分析所需要的操作步骤数量的增加，将杂质DNA引入样品中的可能性 增加，所以最小化用于其检测和定量的样品操作是优选的，特别是在 完成扩增反应后。

已经描述了用于同时扩增和检测靶核酸的方法和装置，目的在于 最小化样品污染的问题。

检测给定的靶核酸序列的存在，并且因此检测特定生物体存在的 一种特定方法是监控PCR循环过程中扩增子的出现。该方法称为实时 PCR。该方法给出了随着循环进行定量扩增序列和计算原始样品中该序 列的量的可能性。该方法使用同源形式，并且在一个管内进行PCR和 检测。在封闭的室中同时进行扩增和检测使由常规PCR后检测方法中 打开管子所引起的污染风险降低。

测定扩增子存在的一种方法是利用某些嵌入染料，当染料嵌入双 链DNA时，其荧光增加，或使其参数改变。一种最常用的染料是SYBR 绿。该方法用于测定双链DNA，主要是溶液中存在的扩增子的量。美 国专利4,683,195和美国专利6,171,785还使用了将可检测的DNA结 合剂(如溴化乙锭)引入扩增反应中，该试剂在PCR溶液中产生可检 测的信号，该信号在结合双链DNA时得到增强。PCR混合物荧光的增 强表示已经发生了扩增。为了有用，该扩增必须是非常特异性的，因 为非特异性扩增也会产生信号。

美国专利6,814,934也提出了用于实时检测溶液混合物中产生的 荧光增强的设备，该荧光增强是由PCR循环过程中双链扩增子的形成 所引起的。

迄今为止可利用的最好的PCR产物检测方法是基于使用扩增子的 特异性探针，其中当溶液中形成或存在该扩增子时，荧光发生改变或 被释放。美国专利4,683,195中描述了用于检测PCR产物的早期方法。 这些方法需要能够与扩增的靶核酸杂交的寡核苷酸探针。这些方法需 要分开的扩增、捕获和检测步骤，并且通常需要几个小时来完成。