[发明专利]赋予除草剂抗性的新型EPSP合酶基因,GRG33、GRG35、GRG36、GRG37、GRG38、GRG39和GRG50

说明书

发明领域

本发明提供了编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)(EPSP)合酶的新型基因，其提供了除草剂抗性。这些基因可用于植物生物学、农作物育种和植物细胞培养。

发明背景

N-膦酰甲基甘氨酸，通常称为草甘膦，是重要的农艺学化合物。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸转化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。这种酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)；在本文中称为“EPSP合酶”)的抑制通过关闭莽草酸途径从而抑制芳香族氨基酸的生物合成而杀死植物细胞。

因为草甘膦类除草剂抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，而且对于细菌细胞也有毒性。草甘膦抑制许多细菌的EPSP合酶，因此对这些细菌有毒。然而，某些细菌的EPSP合酶对草甘膦具有高耐受性。

对草甘膦毒性有抵抗力的植物细胞可以通过转化植物细胞以表达草甘膦抗性细菌EPSP合酶来产生。值得注意的是，来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的细菌基因已用于在植物中在表达后赋予植物细胞以除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。

美国专利6,040,497报告了突变型玉蜀黍EPSP合酶，其具有在位置102处的苏氨酸至异亮氨酸的置换和在位置106处的脯氨酸至丝氨酸的置换(“TIPS”突变)。此类改变将草甘膦抗性赋予该玉蜀黍酶。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且被报告将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。He等人((2001)Biochim et Biophysica Acta 1568：1-6)已通过诱变以及在大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因之间的重组开发出了具有增加的草甘膦耐受性的EPSP合酶，并且提出在位置42(T42M)和位置230(Q230K)处的突变可能是造成所观察到的抗性的原因。

后续工作(He等人(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67：1405-1409)显示，T42M突变(苏氨酸至甲硫氨酸)足以改善大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的酶的耐受性。这些酶包含有在其活性位点中的氨基酸置换，所述氨基酸置换阻止草甘膦的结合而不影响PEP或S3P的结合。在EPSP合酶的2个球状结构域之间的铰链区中发生的突变已显示出改变了草甘膦而非PEP的结合亲和力(He等人，2003，同上)。因此，此类酶即使在草甘膦存在下也具有高的催化活性。

由于除草剂抗性植物提供许多优点，所以用于鉴定具有草甘膦抗性活性的除草剂抗性基因的方法是希望的。

发明概述

提供了用于将除草剂抗性或耐受性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。所述组合物包括编码除草剂抗性或耐受性多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含所述载体的宿主细胞。所述组合物还包括针对除草剂抗性或耐受性多肽的抗体。如所描述的，本发明的核苷酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用以用于转化生物体并在其中表达，所述生物体包括微生物和植物。所述组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。另外，提供了用于产生由本发明的合成核苷酸编码的多肽的方法。