[发明专利]用于鉴别新药物的筛选方法

说明书

本发明涉及允许鉴别新药物的新筛选方法。具体地，本发明涉及 用于选择氨酰-tRNA合成酶(ARS)抑制剂化合物的筛选方法，所述氨酰 -tRNA合成酶(ARS)抑制剂化合物除了其它之外，还能够用作抗菌剂和 抗真菌剂。

背景技术

在现代药物发现程序中，将化学文库与机器人系统组合使用以快 速地评价大量化合物对给定反应的作用。这种方法具有两个主要缺点。 首先，通常需要开发易于监控的生化检测以鉴别候选化合物。由于所 选择药物的潜在的负作用，该方法是昂贵并且不灵敏的。其次，该方 法忽视了生物利用度和毒性参数。由于溶解度、生物利用度或毒性问 题，稍后放弃了大多数起始选择的化合物。

氨酰-t RNA合成酶(下文中所谓的“ARS”)对于药物开发而言代表 着理想的靶标，这是因为它们是普遍分布的必需酶，其遗传性质 (ancestral nature)允许选择特定的抑制剂。此外，它们是可溶的， 稳定的，易于大量表达和纯化，并且可通过一种或多种方法直接检测。 对于所有合成酶的实例可获得X-射线结构，并且已知许多关于氨酰化 反应的机制(参见，Weygand-Durasevic I.等人，“Yeast seryl-tRNA synthetase expressed in Escherichia coli recognizes bacterial serine-specific tRNAs in vivo”，Eur.J.Biochem.，1993，vol. 214，pp.869-877)。

ARS催化特定氨基酸至相应(cognate)tRNA的连接。该反应在单 活性位点结构域内发生，并且典型地分两步进行。首先，氨基酸用ATP 活化以形成氨酰-腺苷酸，并伴随着焦磷酸的释放。接下来，将氨基酸 转移到tRNA的3′末端以产生氨酰-tRNA和AMP。该两步反应通过将特定 的核苷酸三联体(tRNA反密码子)与特定的氨基酸连接来建立遗传密 码。各氨基酸通过其自己的特异ARS识别，所述ARS是普遍分布的。

将氨酰-tRNA合成酶均分为各自约10种酶的两类。类内的所有酶 似乎进化自单结构域ATP结合蛋白。在该结构域上的插入和变化建立了 用于结合tRNA接纳茎的框架。在进化过程中另外的结构域加入至此核 心结构。

通过氨酰-tRNA合成酶的tRNA的识别主要依赖于与tRNA的接纳系 统和反密码子环的分子相互作用(参见.Rich，A.“RNA structure and the roots of protein synthesis”，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，2001，vol.66，pp.1-16)。该酶的活性位点结构域 结合到tRNA分子的接纳臂，其中附加上氨基酸。‘鉴别’碱基 (discriminator base)(在通用CCA序列之前的未配对碱基)，和接纳 茎的第一个三碱基对具有大部分通过ARS活性位点识别的鉴别元件。

在针对翻译的商业抗生素中，一种是靶向tRNA合成酶的。假单胞 菌酸(莫匹罗星(mupirocin))为来自革兰氏阳性传染性病原体的异亮 氨酰-tRNA合成酶(IleRS)的抑制剂。对于病原体与哺乳动物IleRS相 比，假单胞菌酸具有约8000倍的选择性，但是药物的全身生物利用度 的缺乏限制了其用于局部给药。

虽然存在其它已知的针对合成酶的天然产物抑制剂(例如，疏螺 体素、呋喃霉素、榴菌素等)，由于抑制活性的缺乏、不良的特异性或 不良的生物利用度，这些无一开发成商业抗生素。因此，需要更有效 的用于选择ARS抑制剂的方法以筛选大的化学文库和鉴别有希望的药 物候选物。

发明概述

本申请的目的在于提供用于选择ARS抑制剂的筛选方法。

提供了正向筛选方法，其意味着潜在先导化合物的所期望的作用 是援救和/或刺激哺乳动物细胞的生长，并且不抑制任何给定的反应或 阻止细胞培养的生长。因此，在本文提出的正向选择中，将通过那些 能够抑制靶ARS毒性作用的分子援救哺乳动物细胞(特别是人类细胞) 的生长。该作用将简单地通过测量培养密度(一种快速便宜的方法)来 监控。