[发明专利]使用遗传工程化的微生物菌株的改进的鞘氨醇类碱的生产

权利要求书

1.一种获得来自Pichia ciferri或棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)的微生物菌株的方法，所述微生物菌株产生，以每克CDW计，至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱：

或其盐或酯，其中R是X-(CH₂)_m-Y-(CH₂)_n-CH₃，其中

X是CH₂或CHOH，并且

m在0和4之间，并且

Y是CH₂-CH₂,CH＝CH或CH＝CCH₃，并且

n在4和14之间，

所述方法通过如下步骤进行：

A.提高编码具有神经酰胺合酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺，和/或

B.降低编码具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶和/或具有神经酰胺酶活性的酶的多核苷酸的表达，所述具有神经酰胺酶活性的酶能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺，和

C.分离具有以每克CDW计至少0.5mg的式I所示的鞘氨醇类碱的生产力的菌株，

其中所述具有神经酰胺合酶活性的酶选自：

a.由SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成的多肽，

b.由SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成的多肽，

c.由SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列组成的多肽，和

d.由SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列组成的多肽；

其中所述具有神经酰胺酶活性且能够优先或甚至特异性地水解含有式I所示的鞘氨醇类碱的神经酰胺的酶选自：

e.由SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列组成的多肽；

其中所述具有鞘脂Δ8去饱和酶活性的酶选自：

f.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:6所示的氨基酸序

列组成的多肽，和

j.由来自棉桃阿舒氏囊霉的菌株的SEQ ID NO:21所示的氨基

酸序列组成的多肽；

其中所述具有神经酰胺酶活性且能够优先或甚至特异性地水解含有植物鞘氨醇或二氢鞘氨醇作为鞘氨醇类碱的神经酰胺的酶选自：

h.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成的多肽，且

其中来自所述Pichia ciferri或棉桃阿舒氏囊霉的起始微生物菌株为二氢鞘氨醇C-4羟化酶缺陷型菌株。

2.权利要求1的方法，进一步包括提高编码具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶的多核苷酸的表达，其中所述具有二氢神经酰胺去饱和酶活性的酶选自：

i.由来自Pichia ciferri的菌株的SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列组成的多肽，和

j.由来自棉桃阿舒氏囊霉的菌株的SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列组成的多肽。

3.权利要求1或2的方法，其中m是1和/或n是8或10。

4.权利要求1或2的方法，包括用一或多种权利要求1部分A中或权利要求2中限定的编码所述酶的多核苷酸进行DNA介导的转化。

5.权利要求1或2的方法，包括通过遗传学手段将权利要求1部分B中限定的编码所述酶的基因靶定失活。

6.用于生产式I所示的鞘氨醇类碱或其盐或酯的方法，包括通过权利要求1-5任一项的方法获得鞘氨醇类碱产生菌株，在有益于产生所述鞘氨醇类碱的条件下对所述微生物菌株进行发酵，和从发酵液中收集所述鞘氨醇类碱。