[发明专利]肝星状细胞前体及其分离方法

说明书

相关申请的交叉引用 

本申请要求2006年5月26日提交的美国临时申请第60/808,548号的优先权，其公开内容通过引用整体结合入本文。 

技术领域

本发明一般涉及构成成体肝的细胞的前体。具体说，本发明涉及肝星状细胞的前体细胞、包含所述前体细胞的组合物以及分离所述前体细胞的方法。 

背景技术

肝星状细胞(HpStC)在19世纪首次由Kupffer描述，并因为它们在显微镜下观察时“形状”闪耀而命名为″Sternellen″。HpStC是在狄氏间隙中发现的肝特异性间质细胞，并大部分组成为含有维生素A的细胞质脂滴。事实上，脂滴促成了伴随HpStC的“闪耀”性质。 

现在认为HpStC在维生素A化合物的摄取、贮存和释放中起主要作用，这特别对视力、生殖和胚胎发育是必要的。哺乳动物中，约50至80％的全身维生素A正常贮存于HpStC中。 

HpStC在肝中细胞因子、细胞外基质组分(ECM)和基质金属蛋白酶的生成中也起重要作用。许多报道证明，HpStC分泌几种干细胞的分裂素-例如EGF、TGF和HGF-并在肝发育和再生中起重要作用。类似地，许多研究证明，ECM调节失衡是肝纤维化或肝硬化的因素。而且，HpStC的收缩性表明，它们对周细胞具有类似功能，控制血管中局部流速。总之，HpStC的这些种种功能说明它们在健康和失调的肝功能中的显著作用。 

尽管我们日益理解HpStC的重要性，但是HpStC的起源还是未 知的。在早期肝发育中，前肠的内胚层细胞产生肝突，肝突依次发育成周围称为横隔的中胚层并形成肝索。虽然一些人推测HpStC祖细胞可衍生自横隔中的间质细胞，但还没有从其分离出HpStC，实现免疫选择和/或表征前体HpStC的表面标志物还有待鉴定。 

因此，需要明确鉴定HpStC前体的标志物和使所述前体与所述标志物分离的方法。此外，需要体外繁殖HpStC前体细胞的方法。 

发明内容

发明概述 

在本发明的一个实施方案中，提供了获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括(a)提供来自哺乳动物组织的细胞的单细胞混悬液；和，以任何顺序依次或基本上同时，(b)从单细胞混悬液去除表达Ia类MHC抗原的那些细胞；和(c)从细胞混悬液分离对维生素A荧光呈阳性的那些细胞，以获得富集了肝星状细胞祖细胞的细胞群。哺乳动物组织可以是肝、胰腺、肠、肺或骨髓细胞，优选肝。该方法可以进一步包括从细胞混悬液分离对VCAM和/或β3-整联蛋白呈阳性的那些细胞；从细胞混悬液去除那些表达CD45的细胞；和/或从细胞混悬液分离那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。 

在一些实施方案中，分离和去除步骤在流式细胞仪中进行。表达I类MHC抗原的细胞的去除可以使用抗表达那些抗原的细胞的种特异性抗体进行；例如，使用抗鼠肝细胞中RT1A的抗体。而且，肝星状祖细胞可以是人类肝星状细胞祖细胞。 

在本发明另一方面，提供了获得富集了分离的肝星状细胞祖细胞的细胞群的方法，该方法包括：(a)获得肝细胞的细胞混悬液；和(b)以任何顺序依次或基本上同时，(i)从肝细胞的单细胞混悬液分离那些对ICAM-1抗原呈阳性的细胞(ii)去除那些对I类MHC抗原呈阳性的细胞，和(iii)分离那些在流式细胞仪中测量的对维生素A荧光呈阳性的细胞，以获得富集了祖细胞的细胞群。该方法可以进一步包括从细胞混悬液去除那些表达I类MHC抗原、CD45或 两者的细胞，和/或从细胞混悬液分离那些表达结蛋白、巢蛋白、波形蛋白、平滑肌α-肌动蛋白或其组合的细胞。 

在本发明另一个实施方案中，提供了表达VCAM抗原和β3-整联蛋白抗原的分离的肝星状前体细胞。而在本发明另一实施方案中，提供了无性扩增星状前体细胞的方法，该方法包括在无血清培养基中培养表达VCAM抗原和β3-整联蛋白抗原的分离的星状前体细胞。所述培养基科进一步包含生长因子，例如胰岛素、运铁蛋白、白血病抑制因子(LIF)或表皮生长因子(EGF)或其组合。分离的星状前体细胞可以进一步在饲养细胞例如STO细胞存在下培养。 

一方面，在详细解释本发明至少一个实施方案之前，要理解，本发明的应用不限于下述描述中提出或附图中图示的构造的细节和组成部分的布置。本发明包括除了所描述的那些以外的实施方案，并能够以不同的方式实施和实现。而且，要理解，本文采用的措辞和术语以及摘要，是为描述目的，而不应视为限制性的。