[发明专利]用于获得抗原特异性B细胞的克隆群体的培养方法

说明书

本申请要求于2006年5月19日提交的美国临时专利申请系列号 60/801,412的权益。

发明领域

本发明涉及获得抗原特异性细胞的克隆群体的培养方法。

发明背景

培养和鉴定产生对所需抗原有特异性的抗体的B细胞的方法在本 领域是众所周知的。这种B细胞用于回收抗原特异性抗体以及回收编 码这种抗体的核酸序列。这种B细胞还可用于抗原特异性功能测定。

抗体通过免疫系统用于鉴定外源性抗原如毒素、细菌和病毒。每 种抗体结合于抗原的特异性表位。抗体识别特异性表位且与之结合的 能力使抗体成为有用的治疗和诊断工具。除它们的免疫作用之外，实 际上抗体可被产生以识别任何物质，包括其他蛋白质，如生长因子、 激素和酶。

产生单克隆抗体的方法包括体细胞杂交(somatic cell hybridization)-借此动物用抗原进行免疫以诱导免疫反应，该动物 的B细胞被收获且与无限增殖细胞系融合以形成杂交瘤，并且所述杂 交瘤经筛选以鉴定具有抗原特异性的克隆。但是抗原特异性B细胞的 低频率使分离抗原特异性克隆变得困难。当寻找还显示具体的表位特 异性或功能活性的抗原特异性B细胞时，希望的候选物的频率进一步 减少。

此外，可通过从产生对所需抗原有特异性的单克隆抗体的B细胞 克隆编码抗体的核酸序列以及在适合的重组表达系统如哺乳动物细胞 或细菌表达系统中表达由此得到的这些核酸序列或修饰的序列，产生 单克隆抗体。这种方法优于杂交瘤技术，因为它们允许产生无限供应 的具有所需抗原特异性的单克隆抗体，同时也允许这种抗体序列例如 通过人源化或嵌合来进行修饰。

本发明提供了用于分离抗原特异性细胞的克隆群体的培养方法。B 细胞的克隆群体潜在地可用于B细胞功能测定以及用于回收抗原特异 性单克隆抗体和回收编码这种抗体的核酸序列。

附图简述

图1显示了通过收集由抗体选择方案制备的抗IL-6抗体来识别多 种独特表位。表位变异性(Epitope variability)通过抗体-IL-6结合 竞争性研究(ForteBio octet)来证实。

图2显示了通过收集由抗体选择方案制备的抗TNF-α抗体来识别 多种独特表位。表位变异性通过抗体-TNF-α结合竞争性研究 (ForteBio octet)来证实。

图3描述了抗TNF-α抗体的结合亲和力。

图4描述了抗TNF-α抗体的细胞毒性比较。

图5描述了抗Aβ抗体的表位选择性。

图6证实了产生的IgG和示例性IL-6方案的抗原特异性之间的高 度相关性。11孔中的9孔显示了与抗原识别相关的特异性IgG。

图7证实了产生的IgG和示例性huTNF-α方案的抗原特异性之间 的高度相关性。20孔中的18孔显示了与抗原识别相关的特异性IgG。

发明详述

在一个实施方案中，本发明提供了分离抗原特异性B细胞的克隆 群体的方法，所述B细胞可用于分离至少一种抗原特异性细胞。如下 文所述和示例，这些方法包括能分开、组合、连续、重复或周期地使 用的一系列培养和选择步骤。优选地，这些方法用于分离至少一种抗 原特异性细胞，所述抗原特异性细胞能用于产生对所需抗原有特异性 的单克隆抗体或相应于这种抗体的核酸序列。

在一个实施方案中，本发明提供了包括以下步骤的方法：

a.制备包含至少一种抗原特异性B细胞的细胞群体；

b.例如通过色谱法富集细胞群体以形成包含至少一种抗原特异 性B细胞的富集细胞群体；

c.从富集B细胞群体中分离单个B细胞；且

d.测定单个B细胞是否产生对抗原有特异性的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离单个产生抗体的B细胞 的方法的改良，所述改良包括富集从已被免疫或与抗原天然接触的宿 主中获得的B细胞群体，其中所述富集步骤在任何选择步骤之前，包 括至少一个培养步骤，且形成产生对所述抗原有特异性的单个单克隆 抗体的B细胞克隆群体。

遍及本申请，″B细胞克隆群体″是指仅分泌对所需抗原有特异性 的单个抗体的B细胞群体。这就是说，这些细胞仅产生一种类型的对 所需抗原有特异性的单克隆抗体。