[发明专利]来自丝光绿蝇的胰凝乳蛋白酶及其在治疗伤口中的用途

说明书

本发明涉及一种幼虫酶。更具体地说，本发明涉及一种或多种可 从丝光绿蝇(Lucilia sericata)获得的幼虫酶，所述酶可用于组织再生与 伤口愈合。

幼虫侵扰对某些伤口的有益效果已在很多年前就被观察到了。然 而，直到对于感染的抗生素抗性菌株的流行成为医学尤其是伤口愈合 领域中的问题之前，对该过程涉及的机理并没有进行进一步的研究。

之前的研究已经看到幼虫酶作为传统抗生素的添加剂或辅佐剂 (adjuvants)在创口清创中(从伤口去除坏死的、感染的或外来的物质)， 在控制感染中(防止或治疗感染)以及最近的在促进组织再生从而使 伤口处的新组织生长并闭合伤口(愈合)中的作用。所使用的幼虫酶 可以通过清洗幼虫，去除幼虫体表的任何排泄或分泌产物，从整个幼 虫的血淋巴或均浆中获得，这之前进行或不进行幼虫的清洗。之前的 研究还调查了在无菌或非无菌状态下培养幼虫的效果，使用均浆、血 淋巴或排泄/分泌物的效果，以及幼虫年龄的效果(新孵化或一龄或二 龄)。发现所有这些因素都能影响获取自幼虫的产品的性质或活性。

本发明的发明者最近关注于幼虫产物，特别是为幼虫产物组成部 分的酶的伤口愈合特性，所述酶通过促进组织生长而促进伤口闭合。 令人惊讶的是，本发明的发明者已经发现，在丝光绿蝇幼虫的排泄/分 泌物(表面清洗物)中发现的一种或多种胰凝乳蛋白酶在组织形成中 起关键作用：这样的酶经常与组织破裂(breakdown)相联系。

相应地，本发明提供一种源于昆虫幼虫的分离的胰凝乳蛋白酶或 其类似物或其合成形式。

有利地，本发明的胰凝乳蛋白酶已经表现为发挥双重且矛盾的性 质，其不光在伤口清创中(去除坏死的、感染的或外来的物质)有作 用，这是蛋白酶意料之中的性质；还在成纤维细胞粘连(adhesion)(即 组织生长)中有作用，这是蛋白酶完全出乎意料的性质。本发明的胰 凝乳蛋白酶具有选择性活性；其去除或降解某些组织，例如伤口焦痂， 但并不去除或降解所有组织，例如健康的或新的组织。有理由预料这 种或每种蛋白酶将降解或去除组织而不管其类型，例如发生于由铜绿 蝇引起的丽蝇皮肤蝇蛆病的情况，其中坏死的和健康的组织被降解。 同一种酶的清创和促进细胞生长的双重特性是不常见的而且对于本领 域技术人员而言是惊人的，因为这些特性理应是相互矛盾的。

本文使用的术语“焦痂”意在定义任何死亡的组织，其从皮肤的 表面脱落，包括在烧伤、坏疽、溃疡(尤其是压力性溃疡)、感染(尤 其是真菌感染)、晚期暴露于炭疽或任何坏死的组织之后。

昆虫优选的是丝光绿蝇(Lucilia sericata)。

本发明的胰凝乳蛋白酶优选地获取于或可获取于昆虫幼虫的排泄/ 分泌物。然而，相同的成分可能会存在于血淋巴或均浆中，并可以从 这些来源中获取。胰凝乳蛋白酶可以例如通过清洗幼虫并收集清洗介 质来获得。本发明的发明者已经在之前发现昆虫幼虫的排泄/分泌物 (ES)含有组成型表达的和可诱导的成分，包括酶、激素等。出于这 个理由，优选的幼虫的生长状态保持为恒定。在本发明的最优选的实 施方案中，收集和使用的是生长于无菌状态下的新孵化幼虫的排泄/分 泌物。

优选地，胰凝乳蛋白酶具有如图1、图2或图13中所示的序列， 或者其保留天然的或完整的胰凝乳蛋白酶活性的生物活性肽片段，其 活性位点在图1、2和13中被明确。优选地，该片段与图1、2和13 中所确定活性位点或者与编码胰凝乳蛋白酶肽片段的DNA具有高度同 源性，例如活性位点同源性应至少为90％，优选在95％以上，更优选 具有99％的同源性。理想地，片段应与肽活性位点或与编码胰凝乳蛋 白酶肽片段的DNA一致。相关DNA序列示于图1、2和12中。

这些序列的胰凝乳蛋白酶已经表现出具有组织再生性质和清创活 性，但是不降解或消化健康的或活的组织，考虑到其与源自丽蝇皮肤 蝇蛆病(一种组织退化过程)的病因体铜绿蝇的胰凝乳蛋白酶(其即 使对健康的或活组织也具有众所周知的组织降解性质)具有高度同源 性，这尤为令人惊奇。这种同源性在图1和2中进行了展示。

本发明的发明者已经发现ES的组织重塑和再生性质在与抑制胰蛋 白酶样和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基 磺酰氟(PMSF)一起培养后就消失或被抑制了，但是在与仅抑制胰蛋 白酶样丝氨酸蛋白酶的4-(脒基苯基)甲烷磺酰氟(APMSF)一起培 养后则未消失或被抑制。