[发明专利]在酶反应中在样品中合成cDNA的方法

权利要求书

1.在一个酶反应中在一个样品中合成cDNA的方法，其中该方法包括步骤：

(a)准备一种反应混合物，所述反应混合物同时具有末端转移酶活性的第一种 酶、具有反转录酶活性的第二种酶、缓冲液、至少一种核糖核苷酸、至少一种脱氧 核糖核苷酸、锚定寡核苷酸；

(b)在所述反应混合物中加入含有核糖核酸的样品；和

(c)在一个或多个温度步骤中温育所述反应混合物中步骤(a)和(b)的试剂，选择 这些温度步骤以使第一种酶和第二种酶显示活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端转移酶活性是聚腺苷酸化 活性。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品含有核糖核酸，选自 原核RNA、真核RNA、病毒RNA、太古生物RNA、miRNA、snoRNA、mRNA、 tRNA、未聚腺苷酸化的RNA、rRA，及其混合物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸选自聚腺苷酸化 寡核苷酸、聚胞苷酸化寡核苷酸、聚胸苷酸化寡核苷酸、聚鸟苷酸化寡核苷酸、聚 尿苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚腺苷酸化寡核苷酸，额外含有5′-尾的聚胞 苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚胸苷酸化寡核苷酸、额外含有5′-尾的聚鸟苷 酸化寡核苷酸、和额外含有5′-尾的聚尿苷酸化寡核苷酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述锚定寡核苷酸长6-150个核苷 酸，可任选在3′-端具有锚定序列。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述锚定寡核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)、 肽核酸(PNA)、锁闭核酸(LNA)、硫代磷酸脱氧核糖核酸、环己烯核酸(CeNA)， N3-P5-氨基磷酸酯(NP)、或三环脱氧核糖核酸(tcDNA)。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核糖核苷酸可选自腺嘌呤-5′- 三磷酸、胸腺嘧啶-5′-三磷酸、胞嘧啶-5′-三磷酸、鸟嘌呤-5′-三磷酸、尿嘧啶-5′-三 磷酸、具有碱基类似物的核糖核苷酸，其中所述核糖核苷酸可任选的被修饰或标记。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核苷酸可选自脱氧腺 嘌呤-5-三磷酸(dATP)，脱氧胸腺嘧啶-5-三磷酸(dTTP)，脱氧胞嘧啶-5-三磷酸 (dCTP)，脱氧鸟嘌呤-5-三磷酸(dGTP)，脱氧尿嘧啶-5-三磷酸(dUTP)，其中所述 脱氧核糖核苷酸可任选被修饰或标记。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，标记脱氧核糖核苷酸可选自放射性 标记，例如³²P，³³P，³⁵S，³H；荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素 (FAM)、(夹)氧杂蒽、罗丹明、6-羧基-2，4，7，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4，5- 二氯-2，7-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6- 羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹 明110；香豆素，例如7-羟基香豆素；苯甲亚胺，例如Hoechst 33258；菲啶，例如 德克萨斯红、溴乙啶、氮蒽染料、咔唑染料、吩嗪染料、紫菜碱染料、聚甲炔染 料；花青染料，例如Cy3，Cy5，Cy7、BODIPY染料、喹啉染料和Alexa染料。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，修饰选自生物素化、地高辛标记 和半抗原。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，反应物中脱氧核糖核苷酸的浓度 为至少0.01mmol和至多10mmol。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，脱氧核糖核苷酸dATP，dCTP， dGTP和dTTP以0.2mmol-2mmol的浓度存在。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲液pH是6-10，并含有Mg²⁺离子。