[发明专利]用于诊断虾病原体的序列

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请在35U.S.C.§119下要求于2006年8月24日提交的美国临 时申请系列号60/839865的优先权。

发明领域

本发明涉及诊断测试领域。更具体而言，已开发了用于检测虾传染 性皮下及造血器官坏死病毒病原体的新的引物。

发明背景

商业虾养殖场因为大量常见病原体的影响而遭受广泛损失。传染性 皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)是最严重的养殖对虾病毒性病原体 之一。它广泛分布于许多国家，并且具有广泛的宿主范围。例如，IHHNV 引起西方兰虾(Western blue shrimp)(南美兰对虾(Penaeus stylirostris) 的大量死亡以及太平洋白虾(Pacific white shrimp)(南美白对虾(Penaeus vannamei))的变形。IHHNV是小的含单链DNA细小病毒，其完整基因 组已经得到测序(Bonami等人，J.Gen.Virology 71(Pt 11)：657-2664 (1990)；GenBank AF218266)。

IHHNV对于虾养殖业极为有害，是全世界灾难性流行病的原因。 对孵育场孵卵原种(broodstock)和后期仔虾(post-larvae)的IHHNV检测允 许将感染虾在进入商业生产体系之前消除。因此，已开发了检测虾中 IHHNV的多种方法，包括基于核酸的方法和免疫学方法(Lightner等人， Aquaculture 164(1)：201-220(1998))。核酸扩增方法例如聚合酶链反应 (PCR)以及等温扩增方法因其简单、快速和灵敏而备受关注。基于扩增 基因组不同诊断区域检测IHHNV的PCR方法已有描述(见例如Nunan 等人，Mar.Biotechnol.2(4)：319-328(2000)；Yue等人，J.AOAC International 89(1)：240-244(2006)；Tang等人.Dis.Aquat.Org. 44(2)：79-85(2001)；Hu等人，CN 1410549；以及Dhar等人.J.Clin. Microbiol.39(8)：2835-2845(2001))。另外，Sun等人(J.Virol.Methods 131(1)：41-46(2006))描述了检测IHHNV的环介导等温方法。

上述所有方法均可用于IHHNV检测；然而，这些方法通常缺乏特 异性、灵敏度，或者复杂且耗时。另外，由于病毒中的高基因突变率， 针对基因组不同区域的测试将会是有用的。因此，需要快速、准确并且 易于使用于本领域的高灵敏度的IHHNV测定。通过基于IHHNV基因组 新部分的引物的发现，所述问题在此得到解决。在此鉴定的引物可用于 检测IHHNV的引物指导的扩增或核酸杂交测定方法，而不具有前述方 法学相关的问题。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NOs：1-8任一项中所述的 分离的IHHNV诊断引物序列，或者与SEQ ID NOs：1-8完全互补的分离 的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明提供了在此公开的一对不同的两个 IHHNV诊断引物序列，其中该对能够引发扩增IHHNV基因组内核酸区 域的核酸扩增反应。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测IHHNV的试剂盒，包括 至少一对在此公开的IHHNV诊断引物序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在IHHNV的方 法，包括：

(i)提供来自怀疑含有IHHNV的样品的DNA；以及

(ii)在合适的杂交条件下用探针探测该DNA，所述探针来自SEQ ID NOs：1-8任一项的分离的IHHNV诊断引物序列；

其中可杂交核酸片段的鉴定证实了IHHNV的存在。

在其他实施方案中，该检测方法鉴定未被IHHNV感染的DNA样品。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在IHHNV的方 法，包括：

(i)提供来自怀疑含有IHHNV的样品的DNA；以及

(ii)用至少一对在此公开的IHHNV诊断引物序列扩增DNA从而产 生扩增产物；

其中扩增产物的存在证实了IHHNV的存在。

在另一个实施方案中，本发明提供了样品中IHHNV量的定量方法， 包括