[发明专利]用于诊断虾病原体的序列

说明书

与相关申请的交叉引用

本申请在35U.S.C.§119下要求于2006年8月24日提交的美国临 时申请系列号60/839744的优先权。

发明领域

本发明涉及诊断测试领域。更具体而言，已开发了用于检测虾白斑 病综合征病毒病原体的新的引物。

发明背景

商业虾养殖场因为大量常见病原体的影响而遭受广泛损失。白斑病 综合征病毒(WSSV)可以导致商业虾斑节对虾(Penaeus monodon)的 迅速死亡。WSSV是双链DNA杆状病毒，其完整基因组已经得到测序 (van Hulten等人，Virology 286：7-22(2001)；以及Yang等人，J.Virol. 75：11811-11820(2001))。在泰国至少发现12个WSSV变种，其区别在 于可读框(ORF)94内多个重复长度的不同。

WSSV扩散迅速并且可以在两周之内毁灭商业虾的运作。对孵育场 孵卵原种(broodstock)和后期仔虾(post-larvae)的WSSV检测允许将感染 虾在进入商业生产体系之前消除。因此，已开发了检测虾中WSSV的多 种方法，包括基于核酸的方法和免疫学方法(You等人，Current Topics in Virology 4：63-73(2004)；以及Lightner等人，Aquaculture 164(1)：201-220(1998))。聚合酶链反应(PCR)方法因其简单、快速和灵 敏而备受关注。基于扩增基因组不同诊断区域检测WSSV的PCR方法 已有描述(见例如Kou等人，美国专利号6,190,862；Lee，美国专利号 6,872,532；Hameed等人，Aquaculture International 13(5)：441-450(2005)； Jian等人，Diseases of Aquatic Organisms 67(1&2)：171-176(2005)；以及 Durand等人，Journal of Fish Diseases 25(7)：381-389(2002))。另外，基 于PCR的方法，具体而言为WSSV-232测定已经在泰国用于虾工业。 该测定涉及使用ORF21中靶序列的引物检测WSSV DNA (Kiatpathomchai等人，J.of Virology Methods 130：79-82(2005))。然而， 使用WSSV-232测定测试WSSV后已经发生了WSSV感染爆发，其归 因于灵敏度不足(Kiatpathomchai等人，同上)。显然，需要新的及更加 灵敏的WSSV检测测定。

上述所有方法均可用于WSSV检测；然而，这些方法通常缺乏特异 性、灵敏度，或者复杂且耗时。另外，由于病毒中的高基因突变率，针 对基因组不同区域的测试将会是有用的。因此，需要快速、准确并且易 于使用于本领域的高灵敏度的WSSV测定。通过基于WSSV基因组新 部分的引物的发现，所述问题在此得到解决。在此鉴定的引物可用于检 测WSSV的引物指导的扩增或核酸杂交测定方法，而不具有前述方法学 相关的问题。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了SEQ ID NOs：1-8任一项中所述的 分离的WSSV诊断引物序列，或者与SEQ ID NOs：1-8完全互补的分离 的核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明提供了在此公开的一对不同的两个 WSSV诊断引物序列，其中该对能够引发扩增WSSV基因组内核酸区域 的核酸扩增反应。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测WSSV的试剂盒，包括至 少一对在此公开的WSSV诊断引物序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在WSSV的方 法，包括：

(i)提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA；以及

(ii)在合适的杂交条件下用探针探测该DNA，所述探针来自SEQ ID NOs：1-8任一项的分离的WSSV诊断引物序列；

其中可杂交核酸片段的鉴定证实了WSSV的存在。

在其他实施方案中，该检测方法鉴定未被WSSV感染的DNA样品。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中存在WSSV的方 法，包括：

(i)提供来自怀疑含有WSSV的样品的DNA；以及