[发明专利]PCR筛选方法

说明书

本发明涉及新颖的筛选点突变的方法。具体地，其涉及允许甚至 在有其它突变存在下快速且明确地检测这样的突变的筛选点突变的方 法。

基因编码区中的单个核苷酸变化(点突变)可以在生物上具有深远 的生化和生理后果。具有引人注目的后果的这种变化的众所周知的实 例是造成镰状细胞病的突变。还已经将许多其它点突变与健康问题相 关联，所述健康问题范围从糖尿病到心力衰竭，包括例如，参与遗传 性癌、家族性肥厚型心肌病和肌营养不良的那些突变。在农用化学品 领域，已经表明杀虫剂靶酶中的几个点突变赋予对大部分杀虫剂类别 的抗性。例如，已知靶位点突变赋予对主要杀真菌剂和杀虫剂类(分 别例如嗜球果伞素和拟除虫菊酯)以及大多数除草剂类(包括三嗪、草 甘膦、ACCase和ALS抑制剂)的抗性。在许多情况下，已经鉴别出 准确的抗性突变。

例如，在鼠尾看麦娘(black glass)(大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides))中已经表明，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因(ACCase 抑制剂的靶酶，一组控制单子叶杂草、对双子叶植物没有作用的除草 剂)的羧基转移酶结合域内的单个点突变(Ile1781Leu)赋予对环己二酮 (DIM)和芳氧基丙酸盐(FOP)除草剂的广谱抗性(Delye等人2002a)。 已经在其它杂草物种中发现同源突变：黑麦草(瑞士黑麦草(Lolium rigidum)；Delye等人2002b)；野生燕麦(野燕麦(Avena fatua)； Christoffers等人2002)和狗尾草(狗尾草(Setaria viridis)；Delye等 人2002c)。Ile1781Leu突变是由于腺嘌呤5341被置换为胸腺嘧啶或 胞嘧啶。另外，现在已经在ACCase基因中鉴别出赋予其它抗性的突变： Ile2041Asn/Val/Thr突变赋予对FOP的抗性和一些对DIM的抗性，且 其原因是在位置6122的胸腺嘧啶被置换为腺嘌呤或胞嘧啶 (Ile2041Asn/Thr)或在位置6121的腺嘌呤被置换为鸟嘌呤(Ile2041Val)。 (注：为在氨基酸2041处的突变给出的氨基酸和核苷酸位置是来自大 穗看麦娘的；在其它物种中发现了对应的突变)。另一个突变 (Asp2078Gly)赋予对FOP和DIM的抗性。

关于除草剂草甘膦(可能是目前使用的最重要的非选择性除草 剂)，靶是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因。已经在4个 物种(瑞士黑麦草、多花黑麦草(Lolium multiflorum)、小白酒草(Conzya canadensis)和牛筋草(Eleucine indica))中证实了抗性，且怀疑所述 抗性存在于几个其它的物种中(包括苋属(Amaranthus)和藜属 (Chenopodium)物种)。在有些这样的情况下，抗性是由于EPSPS基 因中的Pro106Thr/Ser突变。

使用农用化学品领域作为实例，注意到存在几种用于检测点突变 和它们的互补体的方法，且在有些情况下，可以替代费力且费时的抗 性生物测定。根据它们应用于单个个体还是群体，检测方法可以分成2 大类。例如，单植物测定包括PASA测定(特定等位基因的PCR扩增)、 SSCP测定(单链构型多态性)、CAPS测定(分裂多态序列标记)和 dCAPS测定(衍生的分裂多态序列标记)，同时，基于群体的、定量 PCR(Q-PCR)方法经常基于等位基因特异性的杂交或等位基因特异性 的扩增测定。但是，现有的定性和定量方法的一个共同特征是，可靠 性依赖于在目标点突变周围的其它核苷酸的保守。具体地，在植物中， 已知抗性倾向的物种倾向于在形态学和生理学水平非常不同，且这反 映了在DNA水平的变异性：因此使用现有技术准确检测目标点突变是 非常困难的。例如，未知的多态性可能通过阻止引物的杂交干扰PCR 反应的引发，另外，在例如其中在PCR反应之后需要限制酶消化的 CAPS和dCAPS方法中，在目标突变附近的其它突变的存在可能破坏 限制酶识别。在两种情况下，可能得到不准确的结果(例如抗性的假阴 性或阳性指示)。当然，当在目标点突变位点附近存在多态性时，在测 定人或动物中造成疾病的突变时，也可能发生相同的问题。