[发明专利]半胱氨酸-标记的葡萄球菌G蛋白变体

说明书

技术领域

[1]本发明涉及N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体，编码所述变体的核酸序列、表达载体和宿主细胞，制备所述变体的方法，以及通过使用所述变体或聚合物制造的生物芯片和生物传感器。

背景技术

[2]由于抗体特异性结合抗原的特性，抗体已经被广泛用于涉及疾病的诊断和治疗的医学研究以及生物分析(Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)65-69，Curr.Opin.Chem.Biol，5(2001)40-45)。最近，作为免疫测定，免疫传感器已经被开发，其需要抗体固定在固相支持体上，并测量电流、电阻和质量的变化、或测量光学性质或类似性质(AffinityBiosensors.Vol.7：Techniques and Protocols)。其中，利用光学性质的、基于表面等离子体共振的免疫传感器已经被商业化。所述基于表面等离子体共振的生物传感器提供定性信息(两个分子是否彼此特异性结合)和定量信息(反应动力学和平衡常数)，并且还进行实时检测而不使用标记，因而对于测量抗原-抗体结合特别有用(J.Mol.Recognit.1999.12，390-408)。

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[4]在免疫传感器中，抗体被选择性地并且稳定地固定在固相支持体上是非常重要的。固定抗体的技术被分为两类，物理固定和化学固定。物理固定技术(Trends Anal.Chem，2000 19，530-540)已经被最低限度地使用，因为它们引起蛋白质的变性，并且结果再现性较差。相比之下，化学固定技术(Langmuir，1997，13，6485-6490)已经被广泛应用，原因在于由于它们允许蛋白质通过共价键合的牢固结合的特征，它们显示出良好的再现性和广泛的应用。然而，当应用化学固定技术进行抗体固定时，抗体——不对称的大分子——经常失去它们的取向和与抗原结合的活性(Analyst 121，29R-32R)。

[5]为了增强抗体与抗原结合的能力，在抗体被连接到固体基底之前可以使用载体，并且应用G蛋白作为载体的技术是已知的。然而，问题是当被结合到所述载体上时，该G蛋白本身也失去取向和与抗体结合的能力。

[6]因此，为了解决这类问题，已经提出了各种方法。例如，用2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)处理链球菌G蛋白以进行蛋白质的氨基酸基团的磷酸化，随后该磷酸化的链球菌G蛋白被固定在抗体上。但是，该方法涉及磷酸化具有氨基的氨基酸(精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys))的氨基，而不是磷酸化任何特异位点，因此所述方法导致低的特异性并且在化学处理后需要额外的纯化过程(Biosensors and Bioelectronics，2005，21，1-3-110)。

发明内容

技术问题

[7]为了解决抗体在结合到免疫传感器时失去取向的问题，本发明人已经进行了大量的研究。结果，制备了N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体，并且通过实验确认了所述G蛋白变体的有效性。

技术方案

[8]本发明的一个目标是提供N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体、和编码所述N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体的核酸序列。所述G蛋白来源于，例如，链球菌属(Streptococcus)。半胱氨酸标记物可以通过连接体连接到G蛋白。

[9]本发明的另一个目标是提供包含所述编码所述N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体的核酸序列的表达载体和用所述表达载体转化的宿主细胞。

[10]本发明的又一个目标是提供制备G蛋白变体的方法，所述方法包括培养含有所述表达载体的宿主细胞以表达所述G蛋白变体，和分离所述G蛋白变体。

[11]本发明的又一个目标是提供通过将所述G蛋白变体连接到固相支持体的表面而制造的生物传感器以及制造生物芯片和生物传感器的方法，其中所述G蛋白用硫羟基连接到所述固相支持体。

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附图说明

[13]图1示出与抗体结合的链球菌G蛋白的结合结构域(B1、B2)。

[14]图2A示出用于G蛋白制备的片段和用于G蛋白变体制备的5个片段。图2B示出制备用于G蛋白变体制备的表达载体的方法，其中链球菌G蛋白用1到5个半胱氨酸残基进行标记，所述方法通过将所述片段插入到所述载体而进行(pET-cys1-L-G蛋白、pET-cys2-L-G蛋白、pET-cys3-L-G蛋白、pET-cys4-L-G蛋白、pET-cys5-L-G蛋白；cys：半胱氨酸；L：连接体，四个天冬酰胺残基和一个赖氨酸残基；G蛋白：链球菌G蛋白的结构)。