[发明专利]生产重组生物产品的方法

权利要求书

1、一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物， 该方法包含下述步骤：修饰哺乳动物生产细胞培养物，以调控细胞培养物中至 少一种miRNA在生长周期中的水平。

2、一种生产重组生物产品的方法，该方法采用哺乳动物生产细胞培养物， 该方法包含下述步骤：

(a)在细胞培养初期开始时或过程中，制备哺乳动物生产细胞的生物量； 和

(b)一旦达到希望的哺乳动物生产细胞浓度，造成哺乳动物生产细胞内一 种或多种表1中的miRNA分子水平的增加。

3、如权利要求1或2所述的方法，其中用一种或多种表1中的miRNA分 子瞬时转染所述哺乳动物生产细胞。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述miRNA分子是合成的miRNA前 体分子。

5、如权利要求3或4所述的方法，其中使用脂质体递送、电穿孔或磷酸钙 介导所述转染。

6、如权利要求1或2所述的方法，其中用在转录启动子控制下的包含编码 表1中的miRNA分子的核酸序列的表达载体瞬时转染所述细胞。

7、如权利要求6所述的方法，其中所述核酸序列编码表1中的miRNA分 子的前体。

8、如权利要求6或7所述的方法，其中所述转录启动子是组成型或诱导型 启动子。

9、如权利要求1或2所述的方法，其采用工程化成具有在诱导型启动子控 制下稳定整合到细胞基因组中的表1中的miRNA分子的编码序列或其前体的 哺乳动物生产细胞，且其中该方法包含，在细胞周期的生长停滞期开始时或即 将开始之前，诱导miRNA分子的表达。

10、如权利要求9所述的方法，其中所述启动子是温度诱导型启动子。

11、如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述miRNA分子选自包含 hsa-miR-21和hsa-miR-24的组。

12、如权利要求1所述的方法，其包含下述步骤：在培养初期开始时或在 培养初期过程中，提高哺乳动物生产细胞内一种或多种表1中的miRNA分子 的抑制剂的水平。

13、如权利要求1所示的方法，其中所述至少一种miRNA是初始的、前 体、或成熟的表1中的miRNA。

14、如权利要求12所述的方法，其采用工程化成具有在诱导型启动子控制 下稳定整合到细胞基因组中的抑制剂编码序列的哺乳动物生产细胞，且其中该 方法包含，在培养初期开始时或在培养初期过程中，诱导抑制分子的表达。

15、如权利要求14所示的方法，其中表达由表达诱导物的存在或表达阻抑 物的缺失来诱导。

16、如权利要求14或15所述的方法，其中一旦达到合适的细胞生物量， 就停止诱导miRNA抑制分子的表达。

17、如权利要求1所述的方法，其包含下述步骤：在培养初期开始时或在 培养初期过程中，提高细胞内一种或多种表1中的miRNA分子的抑制剂的水 平，随后在细胞周期的生长停滞期之前或过程中，提高细胞内一种或多种表1 中的miRNA分子的水平。

18、如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞。

19、如权利要求18所述的方法，其中所述CHO细胞是CHO-K1细胞或 CHO-DUKX细胞。

20、如权利要求2至19中任一项所述的方法，其中在比生长初期更低的培 养温度进行生长停滞期。

21、如权利要求20所述的方法，其中在37℃进行生长初期。

22、如权利要求20或21所述的方法，其中在31℃进行生长停滞期。