[发明专利]Fc融合蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种纯化等电点(pI)8.0-9.0的Fc-融合蛋白的方法，包括以下步骤：

a.将含有所述Fc-融合蛋白的液体进行蛋白A或蛋白G亲和层析，其中，在pH为2.8-3.9、选自乙酸钠或柠檬酸钠的缓冲液中进行洗脱，其中，所述缓冲液的浓度为50mM、100mM、150mM、200mM或250mM；

b.将步骤(a)的洗脱物进行强阳离子交换层析，包括加载后用pH6-7、导电率6-10mS/cm、浓度为75-125mM的磷酸钠缓冲液洗涤所述阳离子交换树脂和用pH7.3-8.2、导电率15-22mS/cm的缓冲液洗脱该层析柱；

c.将步骤(b)的洗脱物进行强阴离子交换层析，其中，用导电率3-4.6mS/cm、pH低于所述Fc-融合蛋白pI值一个单位的缓冲液进行平衡和加载，其中，所述缓冲液是浓度为5-35mM的磷酸钠溶液；和

d.将步骤(c)的流出液进行羟基磷灰石层析，收集洗脱物获得纯化的Fc-融合蛋白，其中，在pH6-7、2-10mM浓度磷酸钠和0.4-1M的氯化钾的存在下进行洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在含有以重组蛋白A或蛋白G修饰的交联琼脂糖的树脂上进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述强阳离子交换树脂包括用SO₃^-基团修饰的交联异丁酸酯树脂。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述强阴离子交换树脂包括以N⁺(CH₃)₃修饰的聚苯乙烯/二乙烯基苯树脂。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)在陶瓷羟基磷灰石树脂上进行。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述陶瓷羟基磷灰石树脂包含粒度40微米的颗粒。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括至少一步超滤步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述超滤步骤在步骤(b)与(c)之间和/或步骤(d)之后进行。

9.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括将Fc-融合蛋白 配制到药物组合物中。

10.如权利要求8所述的方法，所述方法还包括将Fc-融合蛋白配制到药物组合物中。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白的等电点(pI)在8.3-8.6之间。

12.如权利要求1-6、10和11中任一项所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的配体结合部分。

13.如权利要求9所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员的配体结合部分。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述配体结合部分选自TNFR1、TNFR2的胞外结构域，或其TNF结合片段。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述配体结合部分选自BAFF-R、BCMA或TACI的胞外结构域，或其能至少结合Blys或APRIL之一的片段。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括选自以下的多肽：

(a)SEQ ID NO：2的氨基酸34-66；

(b)SEQ ID NO：2的氨基酸71-104；

(c)SEQ ID NO：2的氨基酸34-104；

(d)SEQ ID NO：2的氨基酸30-110；

(e)SEQ ID NO：3；

(f)SEQ ID NO：4；

其中所述多肽能结合至少Blys或APRIL之一种。

17.如权利要求1-6、10、11和13-16中任一项所述的方法，其中所述Fc-融合蛋白包括免疫球蛋白的重链恒定区。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述恒定区是人免疫球蛋白的恒定区。