[发明专利]用于抑制神经递质分泌的融合多肽和递送该融合多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过使用由蛋白转导结构域(PTD)与能够结合到能够形成 SNARE复合体的三种蛋白质上的结构域形成的偶联物来抑制神经递质的分 泌，从而促进其递送到细胞中和局部位置的效率。

背景技术

关于神经递质的分泌，由小突触囊泡蛋白(synaptobrevin)(囊泡相关膜 蛋白，VAMP)、SNAP25(兔抗人突触相关膜蛋白25)和突触融合蛋白 (syntaxin)这三种蛋白质形成SNARE复合体，并且这三种蛋白质通过Ca²⁺的刺激向细胞外分泌；所述小突触囊泡蛋白存在于携带神经递质的突触小泡 的表面，SNAP25和突触融合蛋白存在于突触前脂质膜中(参见图1)。

肉毒杆菌神经毒素经常被用作神经递质的分泌的抑制剂，它包括几种亚 型，如肉毒杆菌神经毒素A、B、C、D、E和F，每一种亚型在特定位点切 割VAMP-2、SNAP25和突触融合蛋白，以干扰SNARE复合体的形成，从 而抑制神经递质的分泌(Schiavo et al.Nature 359，832-835，1992)。

由于这种肉毒杆菌神经毒素具有很高的毒性，因此，已有报道，研究集 中在使用由上述的肉毒杆菌神经毒素来切割的肽片段，以抑制神经递质的分 泌。然而，由于仅仅使用完整蛋白质的一部分，因此，与肉毒杆菌神经毒素 相比，所述肽的片段的特异性通常较低，从而具有较低的活性。此外，与肉 毒杆菌神经毒素被递送到细胞中的速度相比，如果所述肽的片段较大，则该 肽被递送到细胞中的速度降低，因此，它在细胞内传导的效率较低，因为， 肉毒杆菌神经毒素被递送到细胞中是以结合到受体的状态进行的(Antonio V.Ferror-Monitiel et al.FEBS letters，435，84-88，1998)。

需要一种在体内和体外都能有效地递送生物活性大分子而不损害细胞 的普通方法(L.A.Sternson，Ann.N.Y.Acad.Sci.，57，19-21(1987))。这种方法的 实例包括：用于脂质肽的化学加成的方法(P.Hoffmann et al.Immunobiol.， 177，158-170(1998))或者使用碱性聚合物(如，聚赖氨酸和聚精氨酸)的方 法(W-C.Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，75，1872-1876(1978))，但是这 些方法还没有被验证。此外，据报道，用作转运蛋白的叶酸以叶酸-偶联物 的形式被转移到细胞中(C.P.Leamon and Low，Proc.Natl.Acd.Sci.，USA，88， 5572-5576(1991))，但是叶酸被递送到细胞质中还没有没证实。此外，假单 胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)也被用作一种转运蛋白(T.I.Prior et al.， Cell，64，1017-1023(1991))。然而，这些方法对于待递送的生物活性物质在细 胞内的传导的效果以及它们普遍的适用性还没有被明确地证实。因此，继续 需要能够将生物活性物质以更安全和更有效的方式，递送到活细胞的细胞质 中或者细胞核中的有效方法。

作为对这种需要的研究的结果，提出了蛋白转导结构域(PTDs)。在 它们当中，作为人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的转录因子的转录反式激活因子 (Tat)蛋白，得到了最彻底的研究。据发现，当转录反式激活因子蛋白由 47-57(YGRKKRRQRRR)个氨基酸组成时(集中了正电荷氨基酸)，比全长 的86个氨基酸的蛋白质形式能更有效地穿过细胞膜(Fawell S.et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 91：664-668(1994))。PTDs的其它实例包括：由单纯疱疹 病毒1型蛋白质(HSV-1)的267^th-300^th氨基酸所组成的肽(Elliott G.et al.， Cell 88：223-233(1997))，和由果蝇的触角足(ANTP)蛋白的第339个至第355 个氨基酸所组成肽(Schwarze S.R.et al.，Trends Pharmacol Sci.21：45-48 (2000))。此外，还发现由正电荷氨基酸组成的人工肽也有效(Laus R.et al.， Nature Biotechnol.18：1269-1272(2000))。

发明内容